苦參對(duì)耐吉非替尼人肺腺癌PC9/ZD 細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及吉非替尼藥物敏感性的影響

沈云飛 詹建偉

肺癌是當(dāng)今世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，其中非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）約占肺癌的75%～80%，5 年生存率低于50%，表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）突變的肺腺癌患者占有較大比例，目前靶向藥物治療被推薦作為一線治療[1]。靶向藥物的廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致癌細(xì)胞對(duì)靶向藥物耐藥而嚴(yán)重影響療效，也是治療失敗的主要原因[2]。如何增加肺癌細(xì)胞對(duì)靶向藥物的敏感性、揭示其耐藥機(jī)制，是目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)[3]。本實(shí)驗(yàn)采用體外苦參作用于耐吉非替尼人肺腺癌PC9/ZD 細(xì)胞，分別通過(guò)MTT 法、流式細(xì)胞術(shù)、侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)經(jīng)苦參干預(yù)的耐藥細(xì)胞株對(duì)吉非替尼藥物敏感性和侵襲轉(zhuǎn)移能力的變化，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞株 人肺腺癌耐吉非替尼PC9/ZD 細(xì)胞株由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供。

1.2 主要試劑和材料 吉非替尼（AstraZeneca UK Limited，規(guī)格：0.25g/片，批號(hào)KK429）；復(fù)方苦參注射液（山西振東制藥股份有限公司，規(guī)格：5mL/支，批號(hào)990809）；磷酸鹽緩沖溶液（批號(hào)YM-S1065）及胰酶（批號(hào)185204）由杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司提供；胎牛血清（批號(hào)10099-141）及DMEM 培養(yǎng)基（批號(hào)SH30023.01B）由北京畢特博生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供；β-Actin 抗體（批號(hào)SC-8007）、山羊抗兔IgG 二抗（批號(hào)SC-5123）、甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）（批號(hào)185041）由杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司提供。

1.3 方 法

1.3.1 常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng) 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人肺腺癌耐吉非替尼PC9/ZD 細(xì)胞株接種至5cm×5cm 大小的培養(yǎng)瓶，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶80%進(jìn)行傳代并進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，傳代時(shí)將部分細(xì)胞凍存至液氮罐中，解凍后細(xì)胞狀態(tài)正常。

1.3.2 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞抑制率 將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的耐吉非替尼PC9/ZD 細(xì)胞株消化離心后鋪板在96 孔板內(nèi)，細(xì)胞濃度為（3～5）×104/mL，每孔100μL 細(xì)胞懸液，將細(xì)胞分為對(duì)照組（不含藥物培養(yǎng)液）、吉非替尼組（吉非替尼0.5、2、8、32μg/mL），每個(gè)濃度梯度設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，邊緣孔用無(wú)菌PBS 填充。培養(yǎng)24h 后進(jìn)行MTT 試驗(yàn)，酶標(biāo)儀波長(zhǎng)為490nm，測(cè)OD 值，觀察細(xì)胞的生存狀態(tài)從而得出IC50。根據(jù)MTT 結(jié)果篩選出最接近IC50 的吉非替尼濃度8μg/mL 與苦參進(jìn)行聯(lián)合，將細(xì)胞分為對(duì)照組（不含藥物培養(yǎng)液）、吉非替尼組（8μg/mL）和苦參聯(lián)合吉非替尼組（0.5mg/mL 苦參+8μg/mL 吉非替尼）進(jìn)行MTT 試驗(yàn)?？鄥舛冗x擇依據(jù)：當(dāng)苦參濃度為0.5mg/mL 時(shí)24h 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率小于10%，因此可視為無(wú)細(xì)胞毒性的苦參濃度。

1.3.3 Western blot 檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 將耐吉非替尼PC9/ZD 細(xì)胞懸液傳代至5cm×5cm 大小的培養(yǎng)瓶，對(duì)照組（不加藥物），吉非替尼組（8μg/mL），苦參聯(lián)合吉非替尼組（0.5mg/mL 苦參+8μg/mL 吉非替尼）培養(yǎng)24h，細(xì)胞長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，采取RIPA 裂解法提取蛋白，選用BSA 母液測(cè)量蛋白濃度，后計(jì)算上樣量跑電泳，PVDF 膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，室溫脫脂奶粉進(jìn)行封閉，一抗孵育2h，PBST 洗脫3 次，二抗孵育2h，PBST 洗脫3 次，ECL 化學(xué)發(fā)光顯色。

1.3.4 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的耐吉非替尼PC9/ZD 細(xì)胞株消化離心后，細(xì)胞濃度為5×104/mL，對(duì)照組（不加藥物），吉非替尼組（8μg/mL），苦參聯(lián)合吉非替尼組（0.5mg/mL 苦參+8μg/mL 吉非替尼）。將60μL 的DEME 培養(yǎng)基稀釋6倍的Matrgel 膠加入transwell 小室中，后在transwell上下室中分別加入200μL 細(xì)胞懸液和含500μL 10%FBS 培養(yǎng)基，設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24h 棄液，并用濾紙吸干，4%多聚甲醛常溫固定15min，0.1%結(jié)晶紫染色液染色20min，烤箱烤干后計(jì)數(shù)觀察，每個(gè)小室隨機(jī)抽取5 個(gè)視野。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量細(xì)胞凋亡 對(duì)照組（不加藥物），吉非替尼組（8μg/mL），苦參聯(lián)合吉非替尼組（0.5mg/mL 苦參+8μg/mL 吉非替尼）培養(yǎng)24h 后，將單細(xì)胞懸液加入離心管中，1500rpm，離心5min 棄上清，加入PBS 洗滌離心棄上清，加入預(yù)冷PFA，4°C固定30min，離心棄上清，PBS 洗滌離心棄上清，加PI室溫避光孵育30min，混勻，上機(jī)檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析與處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，三組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用百分比（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05 提示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 苦參對(duì)吉非替尼誘導(dǎo)的人肺腺癌PC9/ZD 細(xì)胞增殖抑制的影響 吉非替尼組人肺腺癌PC9/ZD 細(xì)胞增殖抑制率（33.46±0.84）%，苦參聯(lián)合吉非替尼組細(xì)胞增殖抑制率（74.59±3.21）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 苦參對(duì)吉非替尼誘導(dǎo)的人肺腺癌PC9/ZD 細(xì)胞EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 在苦參作用下，吉非替尼誘導(dǎo)的人肺腺癌PC9/ZD 細(xì)胞波形蛋白及N 鈣黏蛋白表達(dá)下調(diào)，E 鈣黏附分子表達(dá)上調(diào)，見(jiàn)插頁(yè)圖1。

2.3 苦參可增強(qiáng)吉非替尼對(duì)人肺腺癌PC9/ZD 細(xì)胞的侵襲抑制能力 對(duì)照組、吉非替尼組及苦參聯(lián)合吉非替尼組人肺腺癌PC9/ZD 細(xì)胞侵襲率分別為（91.03±11.02）%、（64.23±8.04）%、（48.59±7.26）%，組間兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)插頁(yè)圖2。

2.4 苦參可增強(qiáng)吉非替尼誘導(dǎo)的人肺腺癌PC9/ZD細(xì)胞凋亡 對(duì)照組人肺腺癌PC9/ZD 細(xì)胞凋亡率（31.14±5.26）%；吉非替尼組細(xì)胞凋亡率（56.48±8.77）%，當(dāng)吉非替尼濃度不變時(shí)，聯(lián)合使用苦參組細(xì)胞凋亡率（76.25±10.28）%，組間兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)插頁(yè)圖3。

3 討 論

腫瘤細(xì)胞發(fā)生耐藥的原因相當(dāng)復(fù)雜，包括耐藥基因異常表達(dá)，DNA 損傷修復(fù)及抑制細(xì)胞凋亡等途徑。苦參的主要活性成分為苦參堿，有報(bào)道顯示，其可通過(guò)抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡克服腫瘤的多藥耐藥現(xiàn)象[4-6]。但是目前，苦參對(duì)吉非替尼誘導(dǎo)的人肺腺癌PC9/ZD 細(xì)胞株耐藥情況尚不明確。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)苦參濃度為0.5mg/mL 時(shí)，可顯著增強(qiáng)吉非替尼誘導(dǎo)的PC9/ZD 細(xì)胞增殖抑制和凋亡敏感性。提示苦參可調(diào)控肺癌細(xì)胞的吉非替尼藥物敏感性。但是其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)過(guò)程改變均會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換（EMT）的異常改變，進(jìn)而改變細(xì)胞的生物學(xué)行為[7]。EMT 以上皮標(biāo)志物蛋白（E-鈣黏蛋白、EpCAM 等）的下調(diào)及間葉標(biāo)志物蛋白（如波形蛋白、纖連蛋白等）的上調(diào)為主要特征，與腫瘤多藥耐藥密切相關(guān)[8-11]。EMT 現(xiàn)象最早在晶狀體細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)[12]，其在肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移和細(xì)胞細(xì)胞耐藥過(guò)程中扮演著重要角色[13-15]。Shintani 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞肺癌組織中，EMT 是造成肺癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇和順鉑產(chǎn)生耐藥的主要原因；Su 等[17]對(duì)吉非替尼耐藥的細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的E-cad 表達(dá)下調(diào)的EMT 特征；通過(guò)對(duì)比非小細(xì)胞肺癌發(fā)生EMT的程度與癌細(xì)胞對(duì)酪氨酸激酶抑制劑類（TKIs）藥物的敏感性相關(guān)度發(fā)現(xiàn)，EMT 程度低得癌細(xì)胞對(duì)TKIs類藥物的敏感性顯著高于EMT 程度高的癌細(xì)胞[18]。提示EMT 可能是TKI 類藥物產(chǎn)生耐藥的重要因素之一。本研究結(jié)果顯示，苦參作用可以顯著增強(qiáng)吉非替尼誘導(dǎo)的PC9/ZD 細(xì)胞波形蛋白、N 鈣黏附蛋白表達(dá)下調(diào)，E 鈣黏蛋白表達(dá)上調(diào)，增強(qiáng)吉非替尼對(duì)細(xì)胞侵襲能力的抑制。提示在耐吉非替尼人肺腺癌PC9/ZD 細(xì)胞中，苦參對(duì)吉非替尼藥物敏感性的影響可能是通過(guò)調(diào)控EMT 過(guò)程實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，苦參能改善耐吉非替尼細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性，可能通過(guò)逆轉(zhuǎn)EMT 過(guò)程改善腫瘤細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程，但是苦參逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)化過(guò)程的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。