長(zhǎng)鏈非編碼RNA 的功能與心血管疾病的研究進(jìn)展

金亮 綜述 陳筱潮 審校

(1.中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 廣州 510120)

人類基因組測(cè)序的完成打開(kāi)了后基因組研究的大門。ENCODE (encyclopedia of DNA elements)研究指出人類幾乎所有的常染色質(zhì)基因組中的核苷酸都被轉(zhuǎn)錄，并確認(rèn)80% 的基因組都具備某種特定功能［1］。但只有一小部分(＜3%)轉(zhuǎn)錄本來(lái)源于蛋白質(zhì)的編碼基因［2］，剩下的非編碼轉(zhuǎn)錄本可能通過(guò)不同的機(jī)制影響基因的表達(dá)。非編碼RNA 根據(jù)其長(zhǎng)度可分為小非編碼RNA(＞200 nt)和長(zhǎng)非編碼RNA(＞200 nt)，其中小編碼RNA 包括miRNAs、piRNA 及siRNA。當(dāng)前研究證實(shí)非編碼RNA 參與許多生物學(xué)功能的調(diào)控，現(xiàn)已明確microRNA 在心力衰竭、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、心肌缺血和再灌注損傷等病理過(guò)程中對(duì)基因表達(dá)的改變起關(guān)鍵作用。然而，lncRNA 在心血管系統(tǒng)疾病中的研究才剛剛起步。現(xiàn)就對(duì)長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNAs，lncRNAs)的功能及其在心血管系統(tǒng)疾病中的相關(guān)作用的研究做一綜述。

1 lncRNA 的結(jié)構(gòu)

lncRNA 是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200 nt 的功能性RNA 分子，存在于胞核或胞漿中。lncRNA 根據(jù)其基因組的定位和背景可以分為正義(sense)、反義(antisense)、雙向(bidirectional)、基因內(nèi)(intronic)、基因間(intergenic)［3］。與蛋白編碼RNA 相比，lncRNA 的保守性要差得多，但在其分子內(nèi)部，卻含有較為保守的序列或二級(jí)結(jié)構(gòu)，且其表達(dá)具有時(shí)空特異性，這些現(xiàn)象都提示lncRNA 具有重要的生理生化功能［3］。有些lncRNA 和mRNA 一樣具有5'帽子結(jié)構(gòu)和PolyA 尾結(jié)構(gòu)，通過(guò)剪切加工而成熟。在大多數(shù)情況下，lncRNA通過(guò)不同的作用機(jī)制參與表遺傳學(xué)的調(diào)控、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。同時(shí)，lncRNA 還可作為小RNAs 的前體和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的組織框架。特定的lncRNA 發(fā)生結(jié)構(gòu)突變，引起表達(dá)水平及定位的改變，已被證明參與許多疾病的發(fā)生發(fā)展［4-6］。

2 lncRNA 的功能

大部分真核基因組經(jīng)轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生了上萬(wàn)種無(wú)或少有蛋白編碼能力的lncRNA，最初被認(rèn)為是RNA 聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄副產(chǎn)物，不具備生物學(xué)功能［7］，進(jìn)一步的研究表明它們通過(guò)與DNA、RNA 或蛋白質(zhì)相互作用調(diào)控基因的表達(dá)。lncRNA 按照功能機(jī)制的不同可分為:信號(hào)分子(signal molecule)、誘餌分子(decoy molecule)、引導(dǎo)分子(guide molecule)和骨架分子(Scaffold molecule)等4 類分子(圖1)［8］。下面依據(jù)lncRNA 參與的生物學(xué)功能分別闡述。

圖1 lncRNA 分子機(jī)制示意圖

2.1 lncRNA 參與表觀基因的沉默

INK4 位點(diǎn)反義非編碼RNA(ANRIL)是周期蛋白依賴性激酶抑制因子2B(cyclin-dependent kinase inhibitor 2B，CDKN2B，即p15INK4b)基因的反義轉(zhuǎn)錄物，參與抑癌基因周期蛋白依賴性激酶抑制因子2A(cyclin-dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A，即p16INK4a)基因的沉默［9］。p15 和p16 都是細(xì)胞周期調(diào)控因子，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。ANRIL 通過(guò)與多梳抑制復(fù)合體1(PRC1)中的組成蛋白Pc/chromobox 7(CBX7)相互作用，再通過(guò)募集PRC2 順式介導(dǎo)p16 的轉(zhuǎn)錄抑制。研究發(fā)現(xiàn)在前列腺癌組織中升高的CBX7 和ANRIL 與降低的p16 密切相關(guān)［10］。另一個(gè)同源異型框基因反義基因間 RNA (HOX anti-sense intergenic RNA，HOTAIR)轉(zhuǎn)錄自同源異型框基因C(homeobox C，HOXC)位點(diǎn)，通過(guò)募集PRC2 反式抑制HOXD 位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄［11］。HOTAIR 的過(guò)表達(dá)將引起其連接的PRC2 復(fù)合體在全基因組范圍內(nèi)的重新定位，使若干個(gè)抑癌基因沉默促進(jìn)了腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。此外，Xist 在沒(méi)有聚合酶Ⅱ(polymerase Ⅱ，polⅡ)的情況下建立了一個(gè)特別的核區(qū)，將要失活的X 染色體被帶入這個(gè)區(qū)域后聚集并在表面形成“外套”，隨后獲得抑制性的組蛋白修飾(如甲基化)，導(dǎo)致失活X 染色體啟動(dòng)子區(qū)域的CpG 島甲基化，X 染色體失活［12］。

2.2 lncRNA 參與細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期調(diào)控

研究表明，lncRNA 也參與細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)控，這主要是通過(guò)對(duì)細(xì)胞周期和凋亡調(diào)控來(lái)實(shí)現(xiàn)。生長(zhǎng)阻滯特異轉(zhuǎn)錄物5(growth arrest-specific transcript 5，Gas5)通過(guò)模擬糖皮質(zhì)激素應(yīng)答元件結(jié)合糖皮質(zhì)激素受體的DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域，阻止糖皮質(zhì)激素受體與應(yīng)答元件的相互作用，從而抑制下游基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［13］。在細(xì)胞DNA 受到損傷時(shí)，p53 能結(jié)合到lincRNA-p21 的啟動(dòng)子區(qū)，激活lincRNA-p21 轉(zhuǎn)錄，該RNA 與核不均一核糖核蛋白K(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K，hnRNP-K)結(jié)合后能特異性地定位到目的基因的啟動(dòng)子區(qū)，導(dǎo)致這些基因的轉(zhuǎn)錄受阻，從而引起細(xì)胞凋亡［14］。周期素D1(CCND1)基因上游區(qū)域轉(zhuǎn)錄出一段lncRNA，參與CCND1 基因轉(zhuǎn)錄的負(fù)向調(diào)節(jié)。通過(guò)連接一個(gè)RNA 連接蛋白TLS，形成lncRNA-TLS 復(fù)合體定位于CCND1 啟動(dòng)子區(qū)，變構(gòu)抑制組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，阻止CCND1 基因的轉(zhuǎn)錄［15］，抑制細(xì)胞周期。

2.3 lncRNA 參與剪切調(diào)控

剪切調(diào)控作為一種轉(zhuǎn)錄后修飾廣泛參與多種生物學(xué)過(guò)程。肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1 (metastasis-associated in lung adenocarcinoma transcript，MALAT-1)與早期非小細(xì)胞肺癌相關(guān)［16］。兩個(gè)新近的研究發(fā)現(xiàn)，MALAT-1 通過(guò)與剪切機(jī)器中富含絲氨酸和精氨酸家族的核磷蛋白相互作用調(diào)控可變剪切［17-18］。據(jù)認(rèn)為，MALAT-1 是作為一個(gè)結(jié)構(gòu)停泊位點(diǎn)聚集特異性的剪切因子(如高效可變剪切所必需的磷酸化SR 蛋白)參與相關(guān)剪切，并調(diào)節(jié)前mRNA 剪切因子分布至核斑點(diǎn)處參與SR 蛋白的磷酸化，改變剪切模式，使MALAT-1缺失的細(xì)胞誤定位和未磷酸化的SR 蛋白水平增加，導(dǎo)致外顯子失表達(dá)數(shù)目增加［18］。

2.4 lncRNA 參與翻譯水平的調(diào)控

β-分泌酶1 反義轉(zhuǎn)錄物(BACE1-antisense transcript，BACE1-AS)是編碼在染色體11q23.3 上的保守RNA，轉(zhuǎn)錄自BACE1 反義鏈。BACE1 蛋白通過(guò)切割β淀粉樣肽前體，產(chǎn)生更多的β 淀粉樣肽［19］。而升高的β 淀粉樣肽、BACE1 蛋白和BACE1-AS 水平與老年癡呆癥相關(guān)，這預(yù)示著B(niǎo)ACE1-AS 表達(dá)的改變可能參與該疾病的進(jìn)展［19］。BACE1-AS 與正義BACE1 mRNA相結(jié)合將增強(qiáng)BACE1 mRNA 的穩(wěn)定性，從而增加BACE1 蛋白在腦內(nèi)的表達(dá)，最終導(dǎo)致β 淀粉樣肽的有毒性聚集［19］。

2.5 lncRNA 參與小RNA 的形成

全基因組研究表明，lncRNA 長(zhǎng)鏈可能是長(zhǎng)度＞200 kb的小RNA 的前體［20］。通過(guò)不同的酶剪切修飾，如Drosha 酶和Dicer 酶序列剪切產(chǎn)生的miRNA 其前體也可能是一段長(zhǎng)鏈lncRNA［21］，也可能通過(guò)加工lncRNA 產(chǎn)生piRNA［22］。

3 lncRNA 與心血管疾病

lncRNA 作為一種新的生物調(diào)節(jié)模式在心血管疾病中的研究才剛剛起步。其在疾病中的調(diào)控及其作用機(jī)制尚不明確，但已有一些研究指出lncRNA 促進(jìn)胚胎發(fā)育中正常血管的形成，其表達(dá)失衡會(huì)引起心臟發(fā)育不全、動(dòng)脈粥樣硬化性血管病及心肌梗死等。深入研究相關(guān)機(jī)制有助于進(jìn)一步闡明疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程，也為新的治療提供潛在靶點(diǎn)。

3.1 lncRNA 與心臟、血管發(fā)育

心臟發(fā)育研究表明，胚胎在不同的發(fā)育階段lncRNA表達(dá)存在很大差異，很可能是參與正常心臟的發(fā)育的新機(jī)制［23］。Braveheart(Bvht)是一個(gè)在大鼠體內(nèi)與心臟相關(guān)的lncRNA，通過(guò)對(duì)胚胎干細(xì)胞不同的分化處理，發(fā)現(xiàn)Bvht 對(duì)于胚胎從新生中胚層到成形心肌是必需的［24］，通過(guò)與PRC2 亞單元SUZ12 相互作用調(diào)控心肌表型［24］。同時(shí)，Bvht 對(duì)于誘導(dǎo)MesP1(一種保守的重要轉(zhuǎn)錄因子)及其下游的靶標(biāo)包括核心心臟轉(zhuǎn)錄因子如Gata4，Gata6，Hand1，Hand2，Tbx2 和Nkx2.5等是必需的［25］。Fendrr 是一個(gè)側(cè)中胚層特異性的lncRNA，控制中胚層的分化及通過(guò)連接組蛋白重構(gòu)復(fù)合體PRC2 和TrxG/MLL 使其分化成為心臟和體壁［26］。缺失Fendrr 的胚胎表現(xiàn)為中胚層特異性轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)異常以及PRC2 在富集位點(diǎn)的減少。lncRNA Kcnq1ot1 通過(guò)調(diào)控一種鉀離子通道編碼基因(Kcnq1)的表達(dá)參與心臟的正常發(fā)育［27］。

3.2 lncRNA 與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化

全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)，在lncRNA 心肌梗死相關(guān)轉(zhuǎn)錄本(MIAT)中有六個(gè)SNP 與心肌梗死相關(guān)。一個(gè)SNP(A11741G)使MIAT 在體外轉(zhuǎn)錄增加1.3倍［28］。編碼MIAT 的基因有5 個(gè)外顯子，體外翻譯分析顯示，MIAT 不編碼任何蛋白質(zhì)，很可能是一個(gè)功能性的RNA，而體外功能分析顯示，第五外顯子上的SNP 變異增加了MIAT 的轉(zhuǎn)錄，這項(xiàng)研究指出SNP 引起的MIAT 表達(dá)水平的改變?cè)谛募」Ｋ乐锌赡芷鹱饔茫?8］。

Leung 等研究發(fā)現(xiàn)RAS 系統(tǒng)也可以通過(guò)lncRNA參與心肌、血管病變的發(fā)生發(fā)展［29］。用血管緊張素Ⅱ培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞，評(píng)估其轉(zhuǎn)錄組反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)許多蛋白編碼mRNA 和非編碼lncRNA 受血管緊張素Ⅱ調(diào)控，且受調(diào)控的Lnc-Ang362 能夠作為miR-221 和miR-222 宿主轉(zhuǎn)錄本，這兩個(gè)miRNA 都與細(xì)胞增殖有關(guān)。用siRNA 干擾Lnc-Ang362 的表達(dá)降低了血管平滑肌細(xì)胞增殖［29］。這為血管緊張素Ⅱ在冠心病研究中提供新的思路，相關(guān)非編碼轉(zhuǎn)錄本也可能成為臨床藥物作用的新位點(diǎn)。

ANRIL 是惟一一個(gè)發(fā)現(xiàn)的位于染色體9p21 區(qū)域的與動(dòng)脈粥樣硬化性血管病敏感性有關(guān)的轉(zhuǎn)錄物［30］。ANRIL 的功能研究顯示它可作為PCG 復(fù)合物(polycomb group，PCG)的骨架與PRC1、PRC2 相連接，通過(guò)表觀順式作用抑制p16INK4a/p15INK4b的表達(dá)［10］。阻止血管平滑肌細(xì)胞由G1 期進(jìn)入S 期，從而抑制血管重塑，防止病理性血管內(nèi)膜增生，抑制動(dòng)脈粥樣硬化的形成。

3.3 lncRNA 與心力衰竭

lncRNA 可通過(guò)調(diào)節(jié)心肌的病理重構(gòu)和心肌肥厚參與心力衰竭的進(jìn)展。心肌重構(gòu)一個(gè)最明顯的改變是α-心肌肌球蛋白重鏈(α-myosin heavy chain，α-MHC)和β-心肌肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain，β-MHC)的比例倒置，這種亞型的改變常發(fā)生在糖尿病、甲狀腺功能低下壓力過(guò)負(fù)荷以及能量缺乏的病理情況下［31］。進(jìn)一步的研究顯示，這種改變很可能是由來(lái)源于α-MHC 和β-MHC 基因間4.5 kb 的轉(zhuǎn)錄本NATs 所介導(dǎo)［32］。新近研究顯示，lncRNA 心臟肥大相關(guān)因子(CHAF)通過(guò)內(nèi)源性吸附miR-489，使其表達(dá)水平下調(diào)。而使miR-489 的靶標(biāo)髓樣分化初級(jí)反應(yīng)基因88(myeloid differentiation primary response gene 88，Myd88)上調(diào)，介導(dǎo)心肌肥厚［33］。此外，與心肌梗死相關(guān)lncRNA 的調(diào)節(jié)異常也是心力衰竭的重要原因之一。全基因組SNP 分析證實(shí)MIAT 基因的改變與心肌梗死的易感性有關(guān)［28］。

4 展望及研究方向

隨著研究的深入，我們對(duì)lncRNA 的功能及與人類疾病的關(guān)系也逐漸清晰，lncRNA 不僅能和DNA、RNA 或蛋白質(zhì)相互作用調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，還可能作為結(jié)構(gòu)分子影響其他RNA(如miRNA)的功能。由于其表達(dá)具有時(shí)間空間特異性，研究確定lncRNA 在正常人中的表達(dá)水平，以及具有臨床診斷意義的變化程度，對(duì)于其作為相關(guān)疾病的生物分子標(biāo)志物為臨床診斷提供新的思路。研究中通過(guò)高通量芯片技術(shù)找到對(duì)應(yīng)疾病的lncRNA 并闡明其表達(dá)水平的變化，進(jìn)一步揭示其主要功能和作用機(jī)制，有助于發(fā)現(xiàn)新的疾病調(diào)控機(jī)制，為臨床的診斷和治療提供新的靶點(diǎn)。

［1］Birney E，Stamatoyannopoulos JA，Dutta A，et al.Identification and analysis of functional elements in 1% of the human genome by the ENCODE pilot project［J］.Nature，2007，447(7146):799-816.

［2］Maher B.ENCODE:The human encyclopaedia［J］.Nature，2012，489(7414):46-48.

［3］Ponting CP，Oliver PL，Reik W.Evolution and functions of long noncoding RNAs［J］.Cell，2009，136(4):629-641.

［4］Struhl K.Transcriptional noise and the fidelity of initiation by RNA polymeraseⅡ［J］.Nat Struct Mol Biol，2007，14(2):103-105.

［5］Wang KC，Chang HY.Molecular mechanisms of long noncoding RNAs［J］.Mol Cell，2011，43(6):904-914.

［6］Wapinski O，Chang HY.Long noncoding RNAs and human disease［J］.Trends Cell Biol，2011，21(6):354-361.

［7］Yap KL，Li S，Munoz-Cabello AM，et al.Molecular interplay of the noncoding RNA ANRIL and methylated histone H3 lysine 27 by polycomb CBX7 in transcriptional silencing of INK4a［J］.Mol Cell，2010，38(5):662-674.

［8］Rinn JL，Kertesz M，Wang JK，et al.Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs［J］.Cell，2007，129(7):1311-1323.

［9］Collins LJ，Chen XS.Ancestral RNA:the RNA biology of the eukaryotic ancestor［J］.RNA Biol，2009，6(5):495-502.

［10］Kino T，Hurt DE，Ichijo T，et al.Noncoding RNA gas5 is a growth arrest-and starvation-associated repressor of the glucocorticoid receptor［J］.Sci Signal，2010，3(107):a8.

［11］Huarte M，Guttman M，F(xiàn)eldser D，et al.A large intergenic noncoding RNA induced by p53 mediates global gene repression in the p53 response［J］.Cell，2010，142(3):409-419.

［12］Wang X，Arai S，Song X，et al.Induced ncRNAs allosterically modify RNAbinding proteins in cis to inhibit transcription［J］.Nature，2008，454(7200):126-130.

［13］Ji P，Diederichs S，Wang W，et al.MALAT-1，a novel noncoding RNA，and thymosin beta4 predict metastasis and survival in early-stage non-small cell lung cancer［J］.Oncogene，2003，22(39):8031-8041.

［14］Bernard D，Prasanth KV，Tripathi V，et al.A long nuclear-retained non-coding RNA regulates synaptogenesis by modulating gene expression［J］.EMBO J，2010，29(18):3082-3093.

［15］Tripathi V，Ellis JD，Shen Z，et al.The nuclear-retained noncoding RNA MALAT1 regulates alternative splicing by modulating SR splicing factor phosphorylation［J］.Mol Cell，2010，39(6):925-938.

［16］Faghihi MA，Modarresi F，Khalil AM，et al.Expression of a noncoding RNA is elevated in Alzheimer's disease and drives rapid feed-forward regulation of beta-secretase［J］.Nat Med，2008，14(7):723-730.

［17］Affymetrix ENCODE Transcriptome Project;Cold Spring Harbor Laboratory ENCODE Transcriptome Project.Post-transcriptional processing generates a diversity of 5'-modified long and short RNAs［J］.Nature，2009，457(7232):1028-1032.

［18］Lee Y，Kim M，Han J，et al.MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase Ⅱ［J］.EMBO J，2004，23(20):4051-4060.

［19］Aravin AA，Hannon GJ，Brennecke J.The Piwi-piRNA pathway provides an adaptive defense in the transposon arms race［J］.Science，2007，318(5851):761-764.

［20］Zhu JG，Shen YH，Liu HL，et al.Long noncoding RNAs expression profile of the developing mouse heart［J］.J Cell Biochem，2014，115(5):910-918.

［21］Klattenhoff CA，Scheuermann JC，Surface LE，et al.Braveheart，a long noncoding RNA required for cardiovascular lineage commitment［J］.Cell，2013，152(3):570-583.

［22］Kriegmair MC，F(xiàn)renz S，Dusl M，et al.Cardiac differentiation in Xenopus is initiated by mespa［J］.Cardiovasc Res，2013，97(3):454-463.

［23］Grote P，Wittler L，Hendrix D，et al.The tissue-specific lncRNA Fendrr is an essential regulator of heart and body wall development in the mouse［J］.Dev Cell，2013，24(2):206-214.

［24］Korostowski L，Sedlak N，Engel N.The Kcnq1ot1 long non-coding RNA affects chromatin conformation and expression of Kcnq1，but does not regulate its imprinting in the developing heart［J］.PLoS Genet，2012，8(9):e1002956.

［25］Ishii N，Ozaki K，Sato H，et al.Identification of a novel non-coding RNA，MIAT，that confers risk of myocardial infarction［J］.J Hum Genet，2006，51(12):1087-1099.

［26］Leung A，Trac C，Jin W，et al.Novel long noncoding RNAs are regulated by angiotensin Ⅱin vascular smooth muscle cells［J］.Circ Res，2013，113(3):266-278.

［27］Burd CE，Jeck WR，Liu Y，et al.Expression of linear and novel circular forms of an INK4/ARF-associated non-coding RNA correlates with atherosclerosis risk［J］.PLoS Genet，2010，6(12):e1001233.

［28］Giger J，Qin AX，Bodell PW，et al.Activity of the beta-myosin heavy chain antisense promoter responds to diabetes and hypothyroidism［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2007，292(6):H3065-H3071.

［29］Haddad F，Qin AX，Bodell PW，et al.Intergenic transcription and developmental regulation of cardiac myosin heavy chain genes［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2008，294(1):H29-H40.

［30］Liu F，Zhou LY，Long B，et al.A long noncoding RNA，CHRF regulates cardiac hypertrophy by targeting miR-489［J］.Circ Res，2014，114(9):1377-1388.