Cx26缺陷遺傳性耳聾病理機制的研究進(jìn)展

袁文慧 李創(chuàng) 余本銓 古韻芳子 朱綱華 肖自安

中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科中南大學(xué)耳科研究所（長沙410011）

GJB2基因編碼的縫隙連接蛋白26（Connexin26，Cx26）是耳蝸中最重要的一種縫隙連接蛋白（Cx），在耳蝸縫隙連接（Gap Junction，GJ）中高度表達(dá)[1]。Cx26是最常見的也是危害最大的耳聾基因[2]，目前發(fā)現(xiàn)Cx26突變不僅可造成先天性耳聾，還可引起遲發(fā)性耳聾。關(guān)于Cx26突變的致聾機制尚不明確，現(xiàn)就近年來由Cx26突變導(dǎo)致的先天性耳聾和遲發(fā)性耳聾的研究進(jìn)展予以綜述。

1 Cx26突變導(dǎo)致耳蝸內(nèi)淋巴液K+循環(huán)障礙的假說被質(zhì)疑

Cx26是β-2型縫隙連接蛋白家族的一員，是構(gòu)成耳蝸GJ的主要蛋白單位。Cx26、Cx29、Cx30、Cx31、Cx32、Cx43和Cx45等縫隙連接蛋白在耳蝸中組成兩套獨立的GJ網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)：（1）內(nèi)耳非感覺上皮細(xì)胞系統(tǒng)，如支持細(xì)胞、齒間細(xì)胞、內(nèi)溝細(xì)胞及鄰接螺旋韌帶的外溝細(xì)胞等（2）內(nèi)耳結(jié)締組織細(xì)胞系統(tǒng)，如耳蝸血管紋、基底膜、螺旋緣及前庭間質(zhì)細(xì)胞等。Cx26是在耳蝸中表達(dá)最強的連接蛋白，在耳蝸兩個GJ系統(tǒng)中都高度表達(dá)。Santos-Sacchi和Dallos在1983年提出了內(nèi)耳GJ功能假說[3]：耳蝸GJ是外毛細(xì)胞(OHC)復(fù)極相K+循環(huán)回流到內(nèi)淋巴的特異性通道，維持著耳蝸內(nèi)淋巴液高K+形成的正電位[4]。簡單來說，K+通過耳蝸GJ系統(tǒng)中的離子通道，先由外淋巴腔流入內(nèi)淋巴腔參與形成毛細(xì)胞感受器電位，維持穩(wěn)定內(nèi)淋巴電位，然后再返回外淋巴腔，形成了耳蝸內(nèi)環(huán)境中的K+循環(huán)。耳蝸K+循環(huán)被認(rèn)為是維持內(nèi)淋巴高K+濃度和耳蝸電位的關(guān)鍵。早期的研究已經(jīng)證實，Cx26的表達(dá)與耳蝸的發(fā)育保持平行，它對維持和促進(jìn)耳蝸的發(fā)育、成熟和功能具有重要意義[5]，同時Cx26在耳蝸GJ通道中對于分子的滲透性表現(xiàn)出很強的電荷選擇性，Cx26突變可能在耳蝸細(xì)胞間信號傳導(dǎo)及營養(yǎng)和能量供應(yīng)中產(chǎn)生特異性、不可彌補的損害，從而導(dǎo)致細(xì)胞變性和聽力喪失，提示Cx26在耳蝸細(xì)胞間信號傳遞及營養(yǎng)和能量供給中具有重要意義[6]。根據(jù)GJ在耳蝸中的功能的假說，學(xué)者們推測Cx26突變導(dǎo)致耳聾的病理機制可能是因為Cx26縫隙連接功能缺陷導(dǎo)致耳蝸內(nèi)淋巴液K+循環(huán)障礙，認(rèn)為GJB2基因突變后產(chǎn)生有功能缺陷或無功能的Cx26蛋白，影響耳蝸GJ的通透性損害GJ的耦合，破壞K+循環(huán)，導(dǎo)致毛細(xì)胞周圍間隙K+積累，產(chǎn)生毒性，最終損害毛細(xì)胞，從而發(fā)生耳聾[7]。

文獻(xiàn)報道，體外細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn)Cx26突變體的病理改變有：(1)突變體（如 p.R184P、p.W24X、p.235delC）不能到達(dá)細(xì)胞膜形成功能縫隙連接斑；（2）突變體（如p.M34T、p.R75W）對野生型Cx26及共同表達(dá)的Cx30有顯性或負(fù)顯性效應(yīng)；(3)突變體（如p.M34T）能被合成并定位到細(xì)胞膜，但不能形成有效的縫隙連接；（4）突變體（如p.V84L）縫隙連接能通過離子，但不能通過小分子如IP3，并影響Corti器發(fā)育；（5）突變體（如p.V84L和p.V95M）能形成功能性同型縫隙連接，但不能組合異型縫隙連接；（6）突變體（如p.G45E）出現(xiàn)異常的半通道活動，在正常水平Ca2+中導(dǎo)致細(xì)胞溶解和死亡；（7）突變體（如p.R75W）影響縫隙連接斑的形成，減小縫隙連接斑面積和蛋白水平；(8)突變體（如p.D50N和p.G11E），細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度異常導(dǎo)致細(xì)胞壞死；（9）突變體（如D50A和A88V）出現(xiàn)半通道活性增強，通過影響細(xì)胞外Ca+濃度從而改變半通道電流，最終導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙和細(xì)胞凋亡[10-16]。這些研究提示，GJB2突變可在Cx26蛋白質(zhì)翻譯、運輸或半通道裝配等不同環(huán)節(jié)影響Cx26縫隙連接細(xì)胞間通信功能[8,9]。有學(xué)者還在Cx26突變患者的顳骨病理切片發(fā)現(xiàn)OHC變性，血管紋發(fā)育不全，螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞正常[17]。懷疑OHC變性可能是OHC內(nèi)高K+濃度中毒所致。但是，迄今未發(fā)現(xiàn)Cx26缺陷耳蝸內(nèi)淋巴液K+循環(huán)受損假說的直接證據(jù)。

而且，耳蝸K+循環(huán)障礙理論不能解釋Cx26缺陷的一些臨床現(xiàn)象和實驗結(jié)果：(1)Cx26和Cx30均在耳蝸相同細(xì)胞豐富表達(dá)，都能很好地通過K+循環(huán)，但Cx26缺失后其功能不能被Cx30補償，而Cx30缺失卻能被Cx26過表達(dá)補償，說明Cx26在耳蝸感覺上皮發(fā)育過程中起著不可替代的作用，是正常聽力必須的功能物質(zhì)[18]。(2)Cheng等在部分GJB2突變耳聾患者中，用耳聲發(fā)射記錄到OHC功能，除少數(shù)GJB2突變外，突變型和聽覺表型之間無明顯相關(guān)性，突變功能改變與表型之間也沒有明確的關(guān)系[19]。(3)在有些突變動物模型中沒有出現(xiàn)毛細(xì)胞凋亡，如R75W突變小鼠，Corti器發(fā)育形態(tài)出現(xiàn)畸形，但OHC發(fā)育正常[20]。(4)有些突變體如p.V84L和p.V95M有離子通透能力，但仍導(dǎo)致耳聾[21,22]。

2 Cx26條件敲除小鼠模型的建立與應(yīng)用

動物模型是基礎(chǔ)生物學(xué)和人類疾病機理研究的基本工具，同時也是疾病防治研究和治療手段開發(fā)的必經(jīng)之路基石所在[23]。因此，成功建立一個Cx26缺陷動物模型對于研究其發(fā)病機理具有非常重要的意義。由于Cx26對于胎盤上的縫隙連接具有非常重要的功能，當(dāng)Cx26缺失時，可影響胚胎組織細(xì)胞60%以上的葡萄糖轉(zhuǎn)運而具有胚胎致死性，Cx26基因敲除小鼠不能建立[24]。2002年，Cohen-Salmon等利用Cre-loxP系統(tǒng)，采用Otog啟動子將Cx26的敲除范圍局限在內(nèi)耳上皮細(xì)胞系統(tǒng)，當(dāng)Otog啟動子在耳蝸內(nèi)表達(dá)時，Cre酶能特異性地識別在Cx26基因中插入的loxP序列，并達(dá)到基因敲除的目的[25]。隨后，由于對Cx26致聾的發(fā)病機制及病理生理過程的深入研究，不同的學(xué)者建立了不同類型的Cx26條件敲除小鼠模型。Lin X團隊在2009年也利用Cre-loxP系統(tǒng)通過3個不同的啟動子（即Pax2、Foxg1、Rosa26）建立了3種不同的Cx26基因敲除小鼠模型[26]。其中Pax2、Foxg1以及Otog基因?qū)儆诙c敲除Cx26小鼠模型，即利用基因重組技術(shù)將Cre序列插入到不同啟動子的基因位點，建立一個Cre基因與小鼠基因的同源重組序列，從而達(dá)到基因敲除的目的。而Rosa26基因?qū)儆诙〞r敲除Cx26小鼠模型，通過體內(nèi)注射人工合成的雌激素拮抗劑他莫昔芬（TMX），激活Cre重組酶，達(dá)到Cx26基因敲除的目的。2013年，Zhao HB團隊提出利用Prox1特異性敲除小鼠耳蝸Deiters細(xì)胞和柱細(xì)胞中Cx26的模型，使得Cx26基因敲除小鼠模型進(jìn)入一個耳蝸亞分區(qū)的時代[27]。由于不同的啟動子表達(dá)的部位不同及表達(dá)時間上的不同，Cx26敲除小鼠模型的表達(dá)模式也具有一定的差異性。Cx26條件敲除小鼠模型的建立推動了Cx26致聾機制的研究。

3 Cx26突變先天性耳聾可能是耳蝸發(fā)育障礙所致

正常小鼠耳蝸在出生后第5天（P5）耳蝸隧道開始張開，P10時耳蝸電位和內(nèi)淋巴液K+濃度達(dá)較高水平，P14出現(xiàn)聽力，P19-P20耳蝸發(fā)育成熟。出生后5天GJB2基因敲除的小鼠，耳蝸Cx26缺失，出現(xiàn)耳蝸發(fā)育障礙和先天性耳聾，表明Cx26在小鼠耳蝸出生后早期（5天內(nèi)）的表達(dá)對耳蝸的發(fā)育和成熟起關(guān)鍵作用[10]。小鼠耳蝸大上皮脊是一個發(fā)育結(jié)構(gòu)，在Corti器成熟過程中起重要作用，出生時存在，一般P10消失，出生后大上皮脊細(xì)胞凋亡是耳蝸正常發(fā)育所必須。在R57W突變敲入小鼠，在P12仍可見大上皮脊細(xì)胞凋亡和形態(tài)保留，說明Cx26功能缺失可能延遲大上皮脊細(xì)胞凋亡，促進(jìn)大上皮脊細(xì)胞生存，導(dǎo)致了Corti器的塌陷，提示Cx26在耳蝸發(fā)育過程中可能在調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡中起著關(guān)鍵作用[9]。

Zhao HB及Lin X等團隊研究認(rèn)為，Cx26缺陷先天性耳聾的最初機制是耳蝸發(fā)育障礙[10,11,26,28]。正常小鼠出生后，耳蝸中Cx26的表達(dá)隨時間直線上升直到小鼠聽力成熟。Lin X等在Cx26敲除小鼠耳蝸中發(fā)現(xiàn)Corti隧道在出生后的耳蝸發(fā)育期均不能打開，認(rèn)為Cx26敲除小鼠中耳蝸Corti器損傷先于聽力損傷，Corti器隧道不能張開是一件標(biāo)志性事件[28]。Liang等研究報道，Cx26敲除小鼠聽力損傷先于毛細(xì)胞丟失和耳蝸細(xì)胞退變，出生后P14天各頻率ABR聽閾在100dB SPL以上，表現(xiàn)為先天性聾，此時觀察到的Corti器并無明顯的細(xì)胞退變和細(xì)胞丟失，但Corti器隧道塌陷。Cx26敲除小鼠成齡后，Corti器出現(xiàn)明顯的毛細(xì)胞、支持細(xì)胞和螺旋神經(jīng)元退化變性，P69天時耳蝸第二回基本上已無毛細(xì)胞和支持細(xì)胞，但嚴(yán)重的毛細(xì)胞缺失和螺旋神經(jīng)元退變僅發(fā)生在底回和中回，膜片鉗記錄顯示基因敲除小鼠OHC功能仍正常[29]。Minekawa等人發(fā)現(xiàn)，Cx26 R75W突變基因敲入小鼠，Corti器的高度變小，中軸橫切面增寬，Corti隧道、Nuel間隙、環(huán)繞OHC周圍間隙缺如，內(nèi)柱細(xì)胞內(nèi)微管數(shù)量明顯減少，Corti器塌陷導(dǎo)致形態(tài)學(xué)改變，支持細(xì)胞增寬引起耳聲發(fā)射受影響失真，OHC發(fā)育正常并保有功能，但畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射（DPOAE）減弱[20]。Jagger等報道，R75W突變小鼠2周時，Corti器隧道存在發(fā)育畸形[30]。Wang等報告Cx26裸鼠耳蝸在出生時總體形態(tài)和細(xì)胞分化無異常，出生后Corti器發(fā)育停滯，Corti隧道和Nuel間隙不張開，P8天時Claudius細(xì)胞退變，P13天時觀察到耳蝸中回OHC開始丟失，但內(nèi)毛細(xì)胞(IHC)完好，從中回開始的大量細(xì)胞凋亡逐漸轉(zhuǎn)向底回，并導(dǎo)致相應(yīng)部位的螺旋神經(jīng)元繼發(fā)退化[26]。Chen S等通過建立一個P0和P8天敲除Cx26小鼠動物模型發(fā)現(xiàn)Cx26參與了出生后Corti器中柱細(xì)胞的骨架構(gòu)成，畸形的骨架構(gòu)成可能會對Corti器的支撐框架產(chǎn)生負(fù)面影響。在PO基因敲除小鼠中，柱細(xì)胞中微管的減少可能是導(dǎo)致Corti隧道無法打開的原因[31]。這些結(jié)果表明，Cx26在小鼠耳蝸出生后對Corti器成熟及聽覺出現(xiàn)前維持Corti器內(nèi)環(huán)境平衡及穩(wěn)定起著重要作用,Cx26缺失導(dǎo)致的先天性聾的最初原因不是耳蝸細(xì)胞退變，而可能是由于耳蝸發(fā)育障礙。

4 Cx26突變遲發(fā)性耳聾可能是因為耳蝸主動放大作用障礙

耳蝸依賴于耳蝸主動放大作用以增強聽覺敏感性和頻率特異性，OHC電致運動是耳蝸主動放大作用的主要來源，OHC電致運動是由質(zhì)膜上馬達(dá)蛋白prestin引起的[32]。Zhao HB及Lin X團隊等研究發(fā)現(xiàn)，Cx26缺陷遲發(fā)性聾是由于耳蝸主動放大作用受損[11,29,33-35]。Zhu等采用時間控制誘導(dǎo)基因敲除技術(shù)，觀察了出生后不同時間點在小鼠耳蝸敲除Cx26對聽覺功能的影響，P5天后敲除Cx26出現(xiàn)類似于臨床的遲發(fā)性耳聾，小鼠出現(xiàn)高頻開始的、輕-中度進(jìn)行性聽力下降，耳蝸發(fā)育正常，無明顯毛細(xì)胞丟失，但DPOAE降低，OHC電致運動相關(guān)非線性電容右移，電壓斜度降低，耳蝸電位降低但與進(jìn)行性聽力減退不關(guān)聯(lián)，提示Cx26缺失損害耳蝸主動放大功能導(dǎo)致遲發(fā)性聾[33]。Wingard等報道，支持細(xì)胞缺失Cx26影響OHC電致運動，Cx26缺失小鼠保持有正常的OHC發(fā)育，但電致運動發(fā)生改變，DPOAE檢測發(fā)現(xiàn)耳蝸主動放大作用減低[11]。在小鼠耳蝸Deiters細(xì)胞和柱細(xì)胞Cx26靶向缺失時，導(dǎo)致OHC超極化，耳蝸主動放大作用降低，DPOAE明顯減小，高頻聽力降低，較短的OHC受影響更明顯，結(jié)果提示耳蝸主動放大依賴于支持細(xì)胞GJ，Cx26缺失降低耳蝸主動放大作用導(dǎo)致聽力減退[27]。研究發(fā)現(xiàn)，在P5天以后的條件性Cx26基因敲除小鼠耳蝸發(fā)育正常，在幼齡有聽力，保持聽覺到青年期，耳蝸隧道正常張開[10,33]。這些研究發(fā)現(xiàn)提示，P5天以后Cx26缺陷影響OHC質(zhì)膜prestin功能，從而耳蝸主動放大作用受損。最近的研究發(fā)現(xiàn)，Cx26靶向缺失的小鼠的聽力損失和主動放大作用的減少是呈漸進(jìn)性的，并且在高頻和低頻區(qū)域是不同的，首先發(fā)生在高頻區(qū)域，然后逐漸延伸到中低頻區(qū)域。這些數(shù)據(jù)表明，GJ對耳蝸主動放大作用的影響是漸進(jìn)性的，在成人的高頻和低頻區(qū)域均存在。這與Zhao HB團隊之前的發(fā)現(xiàn)也一致[36]。

5 總結(jié)與展望

人類遺傳學(xué)的研究已經(jīng)證明，GJ網(wǎng)絡(luò)對于人類聽覺功能的形成不可或缺[37]。而Cx26基因是最常見和危害最大的耳聾基因，了解其致聾的機制無疑是一項偉大的工程，無論是對個人及家庭，還是對整個社會，都具有非常重大的意義。Cx26缺陷可導(dǎo)致先天性耳聾和遲發(fā)性耳聾，兩種表型的耳聾機制可能不同，不能用耳蝸內(nèi)淋巴液K+循環(huán)障礙假說進(jìn)行解釋。Cx26突變導(dǎo)致的先天性耳聾不是由于細(xì)胞的退變和耳蝸電位的降低，而可能是由于耳蝸本身的發(fā)育障礙，發(fā)育障礙會導(dǎo)致頂蓋膜無法移動，無法刺激毛細(xì)胞在聲刺激過程中產(chǎn)生聽覺受體電流。在這個過程中，Corti器隧道能否張開是一件標(biāo)志性的事件。而Cx26突變引起的遲發(fā)性耳聾，則可能是由于OHC電運動減少引起的電生理改變，導(dǎo)致耳蝸主動放大作用受損，從而引起耳聾。而最新的研究顯示Cx26缺失小鼠的耳聾與主動放大作用的降低是漸進(jìn)性的，并且不同頻率之間是不同的。隨著對Cx26突變致聾機制的進(jìn)一步認(rèn)識，在將來有望通過基因編輯、基因功能替代等方法阻止Cx26突變導(dǎo)致耳聾的發(fā)生。