調(diào)節(jié)性T細胞在肺纖維化中作用的研究進展

王在強 傅恩清

肺纖維化是以成纖維細胞增殖、膠原蛋白沉積為特征的肺間質(zhì)過度修復(fù)性疾病。微生物感染、粉塵接觸、藥物作用、射線照射、吸煙、遺傳等因素都可導(dǎo)致肺纖維化[1-2]。盡管導(dǎo)致肺纖維化的因素很多，但它們可能存在共同的致病機制。長期或反復(fù)的細胞損傷啟動了與免疫相關(guān)的損傷修復(fù)程序，造成異常激活的成纖維細胞不斷增殖[3-5]。CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells, Treg)是胸腺來源的CD4+T細胞亞群，持續(xù)性表達IL-2受體α鏈CD25和轉(zhuǎn)錄因子Foxp3[6]。雖然Treg細胞只占健康成人CD4+T細胞的5%～10%，但可以下調(diào)機體對抗原的免疫應(yīng)答，對維持免疫耐受十分重要[7]。人們對Treg細胞促進還是抑制肺纖維化存在較大分歧。Treg細胞可能通過抑制成纖維細胞的增殖直接抑制纖維化,通過抗炎作用和降低輔助性T細胞的反應(yīng)間接抑制纖維化[8-9]。它也可能通過分泌促纖維化細胞因子如血小板源性生長因子B(platelet-derived growth factor-B, PDGF-B)和轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)促進纖維化[7]。肺纖維化中Treg細胞的數(shù)量，有人認為減少，有人認為增多[10-15]。反映出人們對Treg細胞在肺纖維化中的作用了解還不夠深入。本文對Treg細胞在肺纖維化中作用的研究進展作一綜述。

一、肺纖維化中不同亞型的Treg細胞數(shù)量和功能發(fā)生變化

根據(jù)細胞表型和功能的差異，將Treg細胞分為三種亞型：CD45RA-CD25+++激活型Treg細胞、CD45RA+CD25++靜息型Treg細胞和CD45RA-CD25++分泌型Treg細胞[16]。激活型和靜息型Treg細胞具有免疫抑制功能，幾乎不分泌細胞因子。分泌型Treg細胞免疫抑制能力差，可大量分泌 IL-2、 IFN-γ和IL-17細胞因子。激活型Treg細胞絕大部分由靜息型Treg細胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)生，是主要發(fā)揮免疫抑制作用的Treg細胞。靜息型Treg細胞由胸腺生成，一旦靜息型Treg細胞被激活，就可以通過增強FoxP3表達轉(zhuǎn)化為激活型Treg細胞。

Hou等[17]對不同亞型的Treg細胞在特發(fā)性肺纖維化中的作用進行了研究，發(fā)現(xiàn)肺纖維化組與健康對照組外周血中Treg細胞總數(shù)相同，但肺纖維化組中靜息型Treg細胞比例顯著下降，激活型Treg細胞比例升高，分泌型Treg細胞比例沒有變化。肺纖維化組支氣管肺泡灌洗液中激活型Treg細胞的數(shù)量和比例顯著增加。與外周血不同，分泌型Treg細胞在支氣管肺泡灌洗液的比例增加。核蛋白Ki-67是反應(yīng)細胞增殖能力的指標(biāo)[16]。肺纖維化組與健康對照組相比，靜息型Treg細胞表達Ki-67略微升高，而激活型Treg細胞表達Ki-67顯著升高，表明肺纖維化組激活型Treg細胞的增殖能力比健康對照組增強。肺纖維化中激活型Treg細胞增多是免疫穩(wěn)態(tài)被打破的標(biāo)志，并且外周血激活型Treg細胞的比例與肺纖維化嚴(yán)重程度具有相關(guān)性[17]。

T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain protein-3, Tim-3)對Treg細胞發(fā)揮免疫抑制功能具有重要影響[18]。體外實驗中，Tim-3+Treg細胞的抑制作用強于Tim-3-Treg細胞[19]。在急性肺損傷患者的外周血中，Treg細胞數(shù)量和Tim-3在Treg細胞中的表達都顯著提高[20]。Tim-3+Treg細胞能夠減少中性粒細胞的聚集并促進其凋亡，降低膠原蛋白的表達和含量，從而抑制肺損傷后的肺部炎癥和纖維細胞增殖，但Tim-3-Treg細胞沒有這種功能[21]。

二、Treg細胞分泌促纖維化細胞因子可能不是肺纖維化中膠原蛋白沉積的主要原因

Lo等[7]發(fā)現(xiàn)敲除Treg細胞的肺纖維化小鼠與未敲除Treg細胞的肺纖維化小鼠相比，支氣管肺泡灌洗液中TGF-β和PDGF-B水平降低，但膠原蛋白含量相同。敲除Treg細胞的肺纖維化小鼠，可以通過CD4+效應(yīng)T細胞分泌IL-4等細胞因子促進成纖維細胞增殖。促進作用與CD4+效應(yīng)T細胞數(shù)量呈正比，而且促進纖維化的作用，只有在Treg細胞缺失時才能表現(xiàn)出來。Birjandi等[22]發(fā)現(xiàn)注射IL-2復(fù)合物的肺纖維化組與未注射IL-2復(fù)合物的肺纖維化組相比，肺組織中1型細胞因子IL-18含量顯著減少，Treg細胞數(shù)量、膠原蛋白和2型細胞因子(IL-4、IL-5、IL-13)顯著增加，但兩組間TGF-β和PDGF-B水平無差異。TGF-β和PDGF-B是Treg細胞重要的促纖維化細胞因子，在肺纖維化中Treg細胞數(shù)和膠原蛋白含量明顯上升的情況下，兩者均沒有升高。即使在Treg細胞被敲除了的情況下，肺纖維化中膠原蛋白含量依然沒有變化。以上兩點都提示Treg細胞分泌TGF-β和PDGF-B可能不是導(dǎo)致肺纖維化的主要途徑，提示還存在導(dǎo)致肺纖維化中膠原蛋白沉積的其他更重要的途徑。

三、Treg細胞表型發(fā)生改變，抑制功能喪失，促進了肺纖維化

Treg細胞具有很強的可塑性。Zhou等[23]認為局部微環(huán)境以提供特定的細胞因子和/或細胞-細胞(或細胞-微生物)相互作用的方式，決定Foxp3+細胞的轉(zhuǎn)化方向。Voo等[24]發(fā)現(xiàn)外周免疫系統(tǒng)的Treg細胞可以改變表型和功能。黏膜發(fā)炎時，外周血和淋巴組織中表達趨化因子受體6(chemokine receptors 6, CCR6)的Treg細胞可以轉(zhuǎn)化為Th17細胞并分泌IL-17。鮑文華等[25]發(fā)現(xiàn)大鼠肺纖維化組中Th17細胞數(shù)量明顯增多，并且Th17細胞數(shù)與CCR6呈正相關(guān)，說明Th17細胞可能通過與CCR6相互作用參與肺纖維化發(fā)病過程。Foxp3持續(xù)表達是Treg細胞發(fā)揮抑制作用的基礎(chǔ)[26]。Zhou等[27]發(fā)現(xiàn)Treg細胞可以失去表達Foxp3、CTLA-4和CD25的能力，產(chǎn)生IL-2和IFN-γ等炎性細胞因子，喪失免疫抑制功能。Birjandi等[22]將Treg細胞轉(zhuǎn)入Rag1-/-小鼠并用博來霉素誘導(dǎo)肺纖維化，Treg細胞的數(shù)量顯著減少并且表型改變，CD25和Foxp3的表達顯著減少。Bian等[28]發(fā)現(xiàn)矽肺患者Treg細胞數(shù)量增多，但是表達Foxp3的Treg細胞僅占CD4+CD25+T細胞的一小部分，其他Treg細胞表現(xiàn)出Th1和Th17細胞的表型，干擾素和IL-17表達升高而Foxp3和TGF-β表達降低，且Treg細胞抑制CD4+效應(yīng)T細胞增殖的能力顯著下降。Treg細胞和Th17細胞關(guān)系密切，它們各自的特異性轉(zhuǎn)錄因子FoxP3和 RORγT都是TGFβ信號通路的下游靶點[29]。Raijmakers等[30]發(fā)現(xiàn)，正常Treg細胞與CD25+FoxP3+RORγT+IL-17A+促炎性Treg細胞可以相互轉(zhuǎn)化，Toll樣受體2(Toll-like receptor 2, TLR2)和細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4)在兩者間的轉(zhuǎn)化中發(fā)揮了重要作用。TLR2和CTLA-4表達減少促進正常Treg細胞向促炎性Treg細胞轉(zhuǎn)化。正常Treg細胞可有效抑制Th17細胞，但當(dāng)正常Treg細胞轉(zhuǎn)化為促炎性Treg細胞時，就會喪失抑制作用。有研究表明，使用抗CTLA-4抗體的患者，結(jié)節(jié)樣肉芽腫性的發(fā)病率和嚴(yán)重程度都升高[31-32]，CTLA-4表達減少會降低Treg細胞對T細胞的調(diào)控能力[33]。還有研究表明，IL-17+ Treg仍具有抑制功能，只是在IL-1β和IL-6等炎性因子存在的情況下下才會喪失抑制能力[34]。在肺纖維化的微環(huán)境中，Treg細胞表型發(fā)生變化，免疫抑制功能即使沒有完全喪失，也有很大程度的下降。干擾素γ(interferon Type Ⅱ, IFN-γ)和 IL-4能夠抑制Foxp3在Treg細胞中的表達，而CCAAT增強子結(jié)合蛋白(CCAAT/enhance-binding protein, C/EBP)可以解除這種抑制作用，促進Treg細胞的生成并增強其免疫抑制功能[35]。因此，C/EBP可能在維持Treg細胞正常表型中發(fā)揮了重要作用。脂肪干細胞(adipose-derived stem cells, AdSCs)能夠減輕博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化，抑制 Th2型CD4+T細胞分化增殖，促進Treg細胞的分化增殖，改變T淋巴細胞的亞型可能是脂肪干細胞抑制肺纖維化中炎癥反應(yīng)的機制之一[36]。CD4+CD25-效應(yīng)T細胞在某些調(diào)節(jié)下也可以轉(zhuǎn)變?yōu)門reg細胞[37-39]。產(chǎn)生IL-10的調(diào)節(jié)性B細胞(IL-10-producing regulatory B cell, B10) 可以增強Treg細胞功能，促進效應(yīng)T細胞轉(zhuǎn)化為Treg細胞[40-42]。減少B10數(shù)量可以抑制Foxp3的表達，導(dǎo)致Foxp3+ Treg的數(shù)量降低，減輕肺纖維化[43]。

四、提高肺纖維化中Treg細胞的數(shù)量可能會加重肺纖維化

Birjandi等[22]通過IL-2復(fù)合物擴增肺纖維化中的Treg細胞，加重了肺纖維化。咪唑硫嘌呤可以提高Treg細胞數(shù)量，但硫唑嘌呤治療特發(fā)性肺纖維化的多中心臨床試驗顯示，使用硫唑嘌呤后，肺纖維化患者的住院次數(shù)和病死率增加[44-45]。在Treg細胞數(shù)量增加促進肺纖維化方面，兩者觀點相一致。

在博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化中，Birjandi等[22]認為是博來霉素直接誘導(dǎo)了Treg細胞表型的改變。Raijmakers等[30]發(fā)現(xiàn)曲霉菌本身不能抑制CTLA-4的表達，認為是曲霉菌誘導(dǎo)機體產(chǎn)生了正常Treg細胞向促炎性Treg轉(zhuǎn)化所需要的炎癥介質(zhì)。我們認為不是博來霉素直接誘導(dǎo)了Treg細胞表型的改變，而是博來霉素導(dǎo)致肺損傷后，機體產(chǎn)生了能夠誘導(dǎo)Treg細胞表型變化的微環(huán)境。在該微環(huán)境下，Treg細胞表型改變，轉(zhuǎn)化為促炎性Treg，抑制功能喪失，失去了對CD4+效應(yīng)T細胞的抑制作用，造成CD4+效應(yīng)T細胞大量增殖，進而成纖維細胞增殖和膠原蛋白沉積，促進了肺纖維化。這符合不同損傷因素都能導(dǎo)致肺纖維化的事實。因此，在不改變肺內(nèi)微環(huán)境的情況下，即使增加Treg細胞的數(shù)目，Treg細胞也可能會在微環(huán)境下改變表型，喪失功能，不能對CD4+效應(yīng)T細胞發(fā)揮抑制作用，而且會轉(zhuǎn)變?yōu)榇傺仔訲細胞，加重肺纖維化。 Zhou等[23]也認為，當(dāng)肺纖維化微環(huán)境已經(jīng)建立的情況下，Treg細胞治療肺纖維化可能無效甚至有害，因為Treg細胞會在此微環(huán)境下改變表型和功能。在博來霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化后的第14天，過繼轉(zhuǎn)移Treg細胞可以顯著減輕肺纖維化，但研究者沒有對肺纖維化晚期過繼轉(zhuǎn)移Treg的效果進行研究[46]。研究發(fā)現(xiàn)在矽肺模型中，于造模第4周經(jīng)鼠尾靜脈輸入間充質(zhì)干細胞，肺纖維化程度比對照組降低[47]。Liu等[48]進一步發(fā)現(xiàn)使用間充質(zhì)干細胞治療放射性肺損傷時，在急性期(照射后6 h)使用要比在后期(照射后28 d)使用減輕炎癥和抑制纖維化的效果更好。因此，在肺損傷(injuvy of lungs)后肺微環(huán)境改變前進行干預(yù)，對抑制肺纖維化的發(fā)生發(fā)展十分重要，一旦導(dǎo)致肺纖維化的微環(huán)境形成，肺纖維化過程將很難糾正。研究表明，通過抗CD25單抗在肺纖維化早期去除Treg細胞減輕纖維化，而在肺纖維化晚期去除Treg細胞則加重纖維化，因此認為Treg細胞在小鼠肺纖維化的早期起促進纖維化作用，但在肺纖維化的晚期起抑制纖維化作用[49]。我們不認為是一種細胞在疾病不同階段發(fā)揮了相反的作用，可能性更大的是在肺纖維化晚期，使用抗CD25單抗去除了殘存的還能夠正常發(fā)揮抑制功能的Treg細胞，因此會加重肺纖維化。在肺纖維化早期，抗CD25單抗抑制了Treg細胞的生成，減少了后期轉(zhuǎn)化為促炎性Treg細胞的數(shù)量，因此減輕了肺纖維化。

綜上所述， 肺纖維化中不同亞型的Treg細胞數(shù)量發(fā)生變化，而且這種變化與肺纖維化嚴(yán)重程度有相關(guān)性。因此，可以將不同亞型Treg細胞數(shù)量作為判斷肺纖維化患者預(yù)后的指標(biāo)，把恢復(fù)Treg細胞亞型間的平衡作為治療肺纖維化的備選方案[17]。不同亞型的Treg細胞都表達CD25，因此CD25不適合作為篩選不同亞型Treg細胞的標(biāo)志分子，要進一步尋找不同亞型Treg細胞的特異性標(biāo)志分子，以便對不同亞型Treg細胞進行分類研究。Treg細胞表型在肺纖維化中發(fā)生變化，由具有免疫抑制作用的細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榇傺仔约毎?，解釋了肺纖維化中Treg細胞和炎性細胞因子同時增多的現(xiàn)象，阻斷Treg細胞表型改變和恢復(fù)Treg細胞的表型可能成為預(yù)防和治療肺纖維化的新方案。當(dāng)前，對肺纖維化中不同亞型Treg細胞數(shù)量和功能改變的機制還不了解。在肺纖維化微環(huán)境中，促炎性Treg細胞是Treg細胞轉(zhuǎn)變的終末細胞，還是會進一步向Th2和/或Th17細胞轉(zhuǎn)化仍不明確。尤為重要的是，肺損傷后微環(huán)境誘導(dǎo)Treg細胞表型改變的機制尚不清楚，Treg細胞表型和功能改變究盡是肺纖維化的始動因素還是存在上游的調(diào)控作用，已成為當(dāng)前亟待解答的問題。