FeNO與誘導(dǎo)痰細(xì)胞分類檢測(cè)的相關(guān)性

陳華萍 唐心蔚 周雪梅 王 子 李 瑾 王關(guān)嵩

呼出氣一氧化氮(fractional exhaled nitric oxide, FeNO)檢測(cè)和誘導(dǎo)痰細(xì)胞分類檢查作為一種無創(chuàng)性檢查方法，越來越多的用于臨床，其中FeNO廣泛應(yīng)用于哮喘的診斷、治療反應(yīng)的監(jiān)測(cè)以及哮喘患者癥狀控制情況的評(píng)估和急性加重的預(yù)測(cè)[1-5]。目前FeNO 檢測(cè)在我國臨床應(yīng)用的時(shí)間比較晚，且在診斷哮喘的價(jià)值中各國研究結(jié)果報(bào)道亦不一致[6-8]。誘導(dǎo)痰細(xì)胞分類計(jì)數(shù)亦是評(píng)價(jià)慢性氣道炎癥疾病的重要檢測(cè)手段，在早期哮喘、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary, COPD)的病情判斷和療效監(jiān)測(cè)中都發(fā)揮重要作用，特別在嗜酸性粒細(xì)胞性支氣管炎的診斷中，誘導(dǎo)痰中嗜酸性粒細(xì)胞所占比例>3%幾乎是該疾病的唯一診斷依據(jù)[9-11]?？梢?，兩項(xiàng)檢測(cè)均在肺部慢性炎癥疾病的診斷、治療和監(jiān)測(cè)中發(fā)揮重要價(jià)值。FeNO檢測(cè)和誘導(dǎo)痰細(xì)胞分類檢查分別與外周血中嗜酸性粒細(xì)胞比例具有一定的相關(guān)性已有文獻(xiàn)報(bào)道[12]，然而FeNO與誘導(dǎo)痰細(xì)胞檢測(cè)間的相關(guān)性如何，目前這方面的研究報(bào)道甚少。我們分析了FeNO與誘導(dǎo)痰細(xì)胞分類檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性，以期為評(píng)估慢性氣道疾病的診治和監(jiān)測(cè)提供指導(dǎo)意義。

資料與方法

一、一般資料

收集第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院呼吸內(nèi)科門診2018年1月至2018年6月同時(shí)檢測(cè)FeNO和誘導(dǎo)痰細(xì)胞分類項(xiàng)目的患者120例。依據(jù)FeNO值大于25 bbp分為FeNO正常組和升高兩組，其中FeNO正常組(FeNO值=16.28±5.77)男性19例，占33.9%，女性37例，占66.1%，平均年齡(47.18±10.88)歲；FeNO升高組(FENO值=57.36±5.89)男性28例，占43.7%，女性36例，占56.3%，平均年齡(43.29±12.63)歲?；颊呷脒x標(biāo)準(zhǔn)為：①18歲≤年齡≤75歲，性別不限；②有較好的依從性，能配合進(jìn)行FeNO檢測(cè)和誘導(dǎo)痰白細(xì)胞分類檢測(cè)。排除標(biāo)準(zhǔn): ①4周內(nèi)全身使用或吸人糖皮質(zhì)激素；②不能配合FeNO 測(cè)定及誘導(dǎo)痰白細(xì)胞分類檢測(cè)者。FeNO判定標(biāo)準(zhǔn)：≤25 ppb，正常；≥25 ppb，升高。誘導(dǎo)痰白細(xì)胞分類檢測(cè)參考值標(biāo)準(zhǔn)參考我們前期的研究結(jié)果[13]：細(xì)胞總數(shù)：(3.48±3.97)×106/g；嗜酸性粒細(xì)胞比例：(0.07±0.21)%；中性粒細(xì)胞比例：(37.02±13.68)%；淋巴細(xì)胞比例：(2.90±2.22)%；巨噬細(xì)胞比例：(60.7±13.67)%。

二、檢測(cè)方法

1. FeNO檢測(cè): 以無錫納庫倫公司SV42E測(cè)定系統(tǒng)檢測(cè)患者FeNO值。檢測(cè)前向患者充分解釋收集氣體標(biāo)本的呼吸方法，同時(shí)觀看錄像，直至患者完全理解。在FeNO測(cè)定系統(tǒng)聲光和內(nèi)置動(dòng)畫軟件的提示下，引導(dǎo)患者采用正確的呼氣方法，呼出氣流速依據(jù)美國胸科協(xié)會(huì)(ATS)及歐洲呼吸學(xué)會(huì)(ERS)測(cè)定指南進(jìn)行[14]。囑咐患者先將肺部內(nèi)的氣體盡量呼出，然后用口唇緊包過濾器，盡量用力吸氣5 s，然后再次囑咐患者用平穩(wěn)的氣流速度再次將肺部內(nèi)的氣體排出，并維持10 s左右，大約90 s后讀取儀器上顯示的數(shù)值。測(cè)定結(jié)果以ppb表示，所有患者的FeNO檢測(cè)均安排在誘導(dǎo)痰檢測(cè)之前進(jìn)行。

2. 誘導(dǎo)痰細(xì)胞分類檢測(cè)

(1)霧化： 入選患者霧化前給予清水漱口，擤鼻以減少口中唾液的污染。高頻超聲霧化吸入3%高滲鹽水約10 min后，深部咳痰液于痰盒內(nèi)。若患者前述霧化后仍無痰液咳出，或痰量不足，即換用4%高滲鹽水持續(xù)超聲霧化5 min，若仍無痰或痰量不足時(shí)，則換用5%高滲鹽水再霧化，5 min后則終止誘導(dǎo)霧化程序。

(2)痰液的選?。?選用誘導(dǎo)的痰液中黏稠的部分，同時(shí)顯微鏡下觀察痰液標(biāo)本，選取無鱗狀上皮污染的痰液，丟棄唾液，留下合格的痰液標(biāo)本(鏡下每個(gè)低倍視野鱗狀上皮細(xì)胞小于10個(gè)，中性粒細(xì)胞大于25個(gè)/視野)。

(3)痰液的處理： 將合格的痰液裝于5 ml離心管中，稱其質(zhì)量(>0.5 g)，合格痰中加入4 ml的0.1%二硫蘇糖醇(DTT， DTT可將痰液中糖蛋白纖維絲之間的二硫鍵打開，使得痰液溶解, 使其中的細(xì)胞分散，且其對(duì)細(xì)胞形態(tài)無破壞作用，不影響細(xì)胞計(jì)數(shù))，充分混合。將裝有痰液的離心管置于37 ℃水浴鍋中消化10 min，中途搖晃幾次，待痰液完全消化后，用48 μm的尼龍網(wǎng)過濾痰液，濾掉其中的黏液和碎片。收集痰液，以離心半徑8 cm，2 000 r/min離心10 min，去掉上清。向離心管底的細(xì)胞沉淀用200 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸，取20 μl細(xì)胞混懸液于細(xì)胞計(jì)數(shù)板中進(jìn)行細(xì)胞總計(jì)數(shù)，所得細(xì)胞總數(shù)計(jì)算為細(xì)胞數(shù)除以質(zhì)量，最終表達(dá)為：細(xì)胞個(gè)數(shù)×106/g。將剩余細(xì)胞混懸液用于細(xì)胞涂片，將涂片于37 ℃烤干后用甲醇固定10 min，瑞氏-吉姆薩混合染色10 min，沖掉染色液，于烤片機(jī)上37 ℃烤干后光鏡下進(jìn)行400個(gè)非鱗狀細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，包括嗜酸性粒細(xì)胞(eosinophile granulocyte, EOS)、中性粒細(xì)胞(neutrophile granulocyte, NEU)、單核一巨噬細(xì)胞(Monocyte macrophage, MON)、淋巴細(xì)胞(leukomonocyte, LYM)，計(jì)算各細(xì)胞所占比例。注意，痰液標(biāo)本處理過程最好在2 h內(nèi)完成。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

根據(jù)FeNO判定標(biāo)準(zhǔn)：正常，F(xiàn)eNO值≤25 ppb；升高，F(xiàn)eNO值≥25 ppb。其中FeNO正常組，其中FeNO正常組(FeNO值=16.28±5.77)誘導(dǎo)痰細(xì)胞分類中細(xì)胞總計(jì)數(shù)(5.16±3.77)、嗜酸性粒細(xì)胞百分比為(1.18±1.99)%、中性粒細(xì)胞百分比(56.47±18.09)、淋巴細(xì)胞百分比(5.86±6.08)、單核-巨噬細(xì)胞百分比(35.12±14.47)；FeNO升高組(FeNO值=57.36±5.89)誘導(dǎo)痰細(xì)胞分類中細(xì)胞總計(jì)數(shù)(4.96±1.76)、嗜酸性粒細(xì)胞百分比為(11.56±12.80)%、中性粒細(xì)胞百分比(50.43±15.27)、淋巴細(xì)胞百分比(4.95±3.02)、單核-巨噬細(xì)胞百分比(31.33±13.28)；結(jié)果顯示FeNO值升高組較FeNO值正常組FeNO值和嗜酸性粒細(xì)胞百分比均顯著升高，且FeNO水平與誘導(dǎo)痰嗜酸性粒細(xì)胞百分比呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.701，兩組間細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞比例、淋巴細(xì)胞比例和單核巨噬細(xì)胞比例均無顯著性差異(P>0.05)，見表1。

表1 兩組間誘導(dǎo)痰細(xì)胞分類結(jié)果對(duì)比

注：aP< 0. 05，與FeNO 正常組比較

討 論

FeNO主要來自支氣管壁氣道上皮細(xì)胞、T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，由于炎癥因子的刺激，上調(diào)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(nitric oxide synthetase, NOS)，使NO產(chǎn)生增加，F(xiàn)eNO水平升高，可反映哮喘患者氣道炎癥嚴(yán)重程度[15]。目前研究表明NOS在哮喘患者的炎癥細(xì)胞和氣道上皮中表達(dá)較多，而在其他非哮喘患者細(xì)胞中表達(dá)較少，導(dǎo)致哮喘患者FeNO水平顯著升高[16]，這些奠定了FeNO檢測(cè)在哮喘的診治和臨床控制水平中的重要價(jià)值。誘導(dǎo)痰細(xì)胞分類計(jì)數(shù)檢測(cè)通過染色的方法可直觀的觀察患者痰中的各種細(xì)胞比例，其被作為判斷哮喘患者炎癥反應(yīng)表型的金標(biāo)準(zhǔn)，在臨床應(yīng)用中誘導(dǎo)痰細(xì)胞分類除了用于判斷和監(jiān)測(cè)哮喘患者病情外，在慢性阻塞性肺疾病等其他肺部炎癥控制中也有一定指導(dǎo)意義。

從方法學(xué)角度分析，F(xiàn)eNO檢測(cè)具有無創(chuàng)、簡便、高效、快速、可重復(fù)性較好、測(cè)量能夠標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，既往研究亦表明FeNO測(cè)定能有效地監(jiān)測(cè)炎癥變化和指導(dǎo)抗炎治療[17]。但是FeNO測(cè)定容易受到眾多因素的干擾，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，如患者疾病的狀態(tài)、性別因素、吸煙和糖皮質(zhì)激素以及種族等[18]。而誘導(dǎo)痰細(xì)胞分類檢測(cè)亦作為一種無創(chuàng)的檢測(cè)方法，其費(fèi)用低廉容易被患者接受，目前其在臨床上的應(yīng)用已積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，在哮喘、COPD、慢性咳嗽、肺結(jié)核等呼吸道疾病中有廣泛應(yīng)用，在2015年全球哮喘防治倡議(GINA)以及各個(gè)國家哮喘防治指南中均得到推薦[19-20]。但是誘導(dǎo)痰細(xì)胞分類檢測(cè)操作程序較復(fù)雜耗時(shí)、檢測(cè)流程未標(biāo)準(zhǔn)化、各國無統(tǒng)一的參考值，以及需要專業(yè)的技術(shù)人員來操作等缺點(diǎn)。

從兩者在臨床應(yīng)用角度分析，F(xiàn)eNO在哮喘的診斷和評(píng)價(jià)哮喘的治療反應(yīng)和急性加重中已有廣泛應(yīng)用，資料顯示FeNO<25 ppb時(shí)提示嗜酸粒細(xì)胞炎癥可能性低，而 FeNO>50 ppb則提示嗜酸粒細(xì)胞性哮喘[21]。FeNO檢測(cè)亦可用于預(yù)測(cè)吸入激素治療慢性咳嗽的反應(yīng)性，以及鑒別COPD患者嗜酸性粒細(xì)胞的氣道炎癥表型[22]。誘導(dǎo)痰細(xì)胞分類檢測(cè)是鑒別慢性咳嗽(咳嗽變異性哮喘(cough variant asthma, CVA)、鼻后滴流綜合征、胃-食管反流性咳嗽以及嗜酸性粒細(xì)胞支氣管炎(eosinophil bronchitis, EB))中EB的唯一方法，因?yàn)镋B缺乏特征性的臨床表現(xiàn)，且部分臨床表現(xiàn)與CVA類似，其體格檢查亦無異常，EB的診斷目前主要依據(jù)誘導(dǎo)痰細(xì)胞分類中嗜酸性粒細(xì)胞百分百>3%判定。其次，誘導(dǎo)痰細(xì)胞分類檢測(cè)在哮喘的診治中可用于評(píng)價(jià)哮喘患者的氣道炎癥嚴(yán)重程度，以及藥物療效。在COPD的應(yīng)用中誘導(dǎo)痰中性粒細(xì)胞數(shù)目可與肺功能聯(lián)合判斷患者的氣道炎癥情況。

本研究通過比較患者FeNO值與誘導(dǎo)痰中各細(xì)胞比例的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)eNO值升高的患者其誘導(dǎo)痰中嗜酸性粒細(xì)胞比例也顯著升高(P<0.05)，F(xiàn)eNO值正常的患者誘導(dǎo)痰中嗜酸性粒細(xì)胞比例也較FeNO升高組顯著降低(P<0.05)，相關(guān)性分析顯示FeNO水平與誘導(dǎo)痰嗜酸性粒細(xì)胞水平呈正相關(guān)(r=0.697)，說明兩種檢測(cè)手段結(jié)果一致性較好，均可反映氣道炎癥水平，這與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相一致[23]，誘導(dǎo)痰嗜酸性粒細(xì)胞作為氣道炎癥的重要生物學(xué)標(biāo)志物，其水平亦可反映氣道炎癥的嚴(yán)重程度，F(xiàn)eNO檢測(cè)亦主要用于評(píng)價(jià)哮喘患者嗜酸性炎癥。

綜上，F(xiàn)eNO檢測(cè)和誘導(dǎo)痰細(xì)胞分類檢測(cè)在應(yīng)用范圍和操作流程上均有自己的優(yōu)缺點(diǎn)，但二者都不能被其中一個(gè)所取代，兩者互相彌補(bǔ)了各自的缺點(diǎn)。因此，在臨床應(yīng)用中，將FeNO檢測(cè)和誘導(dǎo)痰細(xì)胞分類檢測(cè)有機(jī)的結(jié)合起來評(píng)價(jià)和監(jiān)測(cè)慢性呼吸道疾病炎癥水平，對(duì)提高對(duì)患者疾病的管理和監(jiān)測(cè)，也可為哮喘、嗜酸性粒細(xì)胞性支氣管炎和COPD診治和管理提供重要的輔助工具。