NPTX2基因DNA甲基化與胰腺癌的研究進展

章俊亞, 陳吉祥

胰腺癌是全球癌癥相關死亡的第5大病因,其5年生存率僅為7%[1-2]。胰腺癌患者早期缺乏特異性癥狀且進展迅速,確診時往往已發(fā)生局部浸潤和遠處轉(zhuǎn)移,失去手術切除機會[3-6]。據(jù)統(tǒng)計,僅10%～20%的胰腺癌患者可接受手術治療,不接受手術治療的患者,平均生存時間為確診后3～6 個月[7]。此外,胰腺癌對化療藥物具有高度的抗性,化療效果不佳[8]。一些有創(chuàng)、侵入性的臨床輔助檢查,如內(nèi)鏡下逆行膽胰管造影(ERCP)、腹腔鏡超聲內(nèi)鏡等,有出現(xiàn)胰腺炎并發(fā)癥的可能[9]。因此,探索胰腺癌早期診斷的潛在標志物以及治療靶點,已成為胰腺癌研究領域的熱點。糖基抗原CA 19-9是迄今報道的胰腺癌敏感性最高的標志物,但通常在胰腺癌的晚期出現(xiàn)異常升高,在肝癌、膽囊癌等其他腫瘤,風濕性關節(jié)炎,急慢性胰腺炎等也可出現(xiàn)升高趨勢[10]。

腫瘤的發(fā)生是由傳統(tǒng)基因遺傳學和表觀遺傳學調(diào)控共同作用的結果。表觀遺傳學調(diào)控是在不發(fā)生原始DNA序列變化的前提下,在細胞分裂過程中對調(diào)控基因進行修飾,使遺傳物質(zhì)改變并隨著細胞的增殖向下遺傳,進而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。表觀遺傳學調(diào)控機制主要包括DNA甲基化、染色質(zhì)的組蛋白修飾(包括甲基化、乙?；?、基因印跡以及RNA干擾等。DNA 甲基化在胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起著關鍵性的作用,能夠使某些抑癌基因失活,從而促進致癌的過程。先前研究證實在胰腺癌中,神經(jīng)元正五聚體蛋白Ⅱ(neuronal pentraxin Ⅱ,NPTX2)NPTX2基因的啟動子區(qū)域CpG島發(fā)生異常高甲基化[11]。DNA甲基化可能是導致胰腺癌中NPTX2蛋白功能失活、表達沉默的機制之一。就此,本文對NPTX2 的 DNA 甲基化在胰腺癌中的最新研究進展做一綜述。

1 NPTX2基因

NPTX2基因位于人類七號染色體(7q21.3-q22.1)，長度為11 kb，其編碼的神經(jīng)元正五聚體蛋白Ⅱ是一種神經(jīng)突觸蛋白，能夠參與興奮性突觸的形成，最初在帕金森病中被發(fā)現(xiàn)，廣泛存在于胰腺、肝臟、大腦、骨骼肌等組織[12-13]。NPTX2是神經(jīng)元正五聚蛋白家族(neuronal pentraxin，NPs)中的成員之一，該家族其他成員有神經(jīng)元正五聚體蛋白Ⅰ(neuronal pentraxin Ⅰ，NPTX1)、神經(jīng)元五聚蛋白受體(neuronal pentraxin receptor，NPTR)，NPTX2蛋白能夠和NPTX1、NPTXR結合形成異聚體[14]。NPTX2具備五聚體家族蛋白的特點：①由5個一致的非共價結合的亞基呈放射狀排布所形成的五聚體，其形成的過程不依賴Ca2+；②標志性序列形式為H-X-C-X-S/T-W-X-S/T(X可代表各種氨基酸)；③依賴Ca2+和各種配體結合，在Ca2+存在環(huán)境下，可與太攀蛇毒素(一種高效的異木防己堿毒素，能夠阻斷突觸前的神經(jīng)-肌肉傳導)和腔內(nèi)鈣結合蛋白TCBP49結合[15]。根據(jù)NPTX2這一生化特性，常將其作為該蛋白分離純化的一種有效方法。

NPTX2與人體多種疾病相關。例如,NPTX2蛋白在患有阿爾茲海默病的患者腦脊液中減少,且與患者認知表現(xiàn)和海馬體積具有顯著相關性[16];NPTX2過度表達能夠減輕應激誘導的焦慮行為,在焦慮癥治療中起著潛在的重要作用[17];NPTX2的表達下降可能參與了發(fā)作性睡病的發(fā)病機理[18];NPTX2還被發(fā)現(xiàn)參與了人類神經(jīng)母細胞瘤的發(fā)生發(fā)展[19]。近年來,諸多研究對NPTX2在胰腺癌方面的研究越來越多,為胰腺癌發(fā)病機制的探索提供了新的理論指導和方向。

2 DNA甲基化

DNA甲基化是最重要的表觀遺傳改變之一,在腫瘤的發(fā)展中起著關鍵的調(diào)控作用,異常的DNA甲基化涉及啟動子CpG島的CpG高甲基化狀態(tài),最終導致腫瘤抑制基因沉默或通過促進基因組的不穩(wěn)定從而導致染色體的缺失[20]。DNA甲基化則是在 DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的催化下,胞嘧啶的第5位碳原子與S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基結合生成5′-甲基胞嘧啶的過程。在真核細胞中,DNA 甲基化大部分出現(xiàn)在 5′-GC-3′ 核苷酸即CpG上[21]。富含CpG 的DNA區(qū)域被稱為CpG島,CpG 一般位于基因的啟動子區(qū)附近,長度為300～3 000 bp。在正常情況下,CpG 島以非甲基化形式存在,當CpG 島發(fā)生異常甲基化(以過甲基化為主)時,甲基化結合蛋白以及轉(zhuǎn)錄抑制物組蛋白乙?；傅冉Y合到CpG島,使轉(zhuǎn)錄因子結合啟動子的過程受阻,從而導致啟動子區(qū)域下游基因的失活[22]。

DNA異常甲基化廣泛出現(xiàn)在各類腫瘤中,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。Chou等[23]發(fā)現(xiàn)抑癌基因ABCA1在卵巢癌細胞系中出現(xiàn)高甲基化,且與卵巢癌患者的不良預后密切相關。另有研究發(fā)現(xiàn),在肺癌組織中檢測到DBCCR1基因CpG島的高甲基化水平,致該基因的表達沉默,增強了癌細胞遷移、侵襲的能力,被認為是早期肺癌的診斷指標之一[24]。Chen等[25]研究表明,TMEFF2 基因啟動子區(qū)異常甲基化與子宮內(nèi)膜癌的早期發(fā)生相關。同樣,許多與胰腺癌發(fā)病有關的基因也出現(xiàn)啟動子區(qū)域的高甲基化修飾,例如參與DNA 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的基因INSM2、調(diào)控細胞增殖的基因GAS6、與凋亡相關的基因IRF5等均發(fā)生了啟動子區(qū)的異常甲基化,出現(xiàn)基因功能紊亂、表達抑制,進而導致腫瘤形成[26-28]。DNA甲基化改變通常發(fā)生于細胞癌變過程的早期階段,因此它能夠作為腫瘤發(fā)生的重要危險因素和早期診斷的分子標志物,將甲基化檢測投入到高危人群的篩查,提高早期診斷的準確性。

3 NPTX2的DNA甲基化與胰腺癌

2003年,Sato等[11]通過高通量微陣列技術的研究,發(fā)現(xiàn)NPTX2基因在胰腺癌組織中表達下降,同時其啟動子區(qū)CpG島發(fā)生異常高甲基化,而正常胰腺組織細胞中很少出現(xiàn)甲基化,表明NPTX2基因的表達抑制可能參與了胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過程,且該基因表達抑制可能與DNA高甲基化相關。隨后,有關于胰腺癌中NPTX2的DNA異常甲基化的研究陸續(xù)地開展起來。2006年,Matsubayashi等[29]在胰腺癌的胰液中發(fā)現(xiàn)了一些高甲基化基因:NPTX2、Cyclin D2、FOXE1、p16、ppENK和TFPI2,其中NPTX2基因相比于其他基因檢測的敏感性更高。2007年,Park等[30]運用超聲內(nèi)鏡結合胰管刷檢技術獲取了33例胰腺癌患者及22例良性胰膽病患者的細胞樣本,從中提取細胞基因組DNA,NPTX2基因的啟動子區(qū)域 CpG島高甲基化序列經(jīng)過亞硫酸氫鹽處理修飾后,設計相應引物與該序列互補配對,通過定量甲基化特異PCR法(quantitative methylation-specific PCR, QMSP)進行檢測,結果發(fā)現(xiàn)胰腺癌細胞中NPTX2甲基化明顯增高,認為NPTX2高甲基化的定量分析將有望成為一種胰腺癌分子診斷標志物。2012年,Park等[31]再次采集了169例患者的血液標本進行研究,其中包括104例胰腺癌患者,60例慢性胰腺炎患者,5例良性膽道結石病患者,并從每例患者的血漿中提取DNA,通過QMSP法檢測NPTX2基因CpG島高甲基情況。結果表明,相比于慢性胰腺炎組和良性膽道結石組,胰腺癌組NPTX2的高甲基化水平顯著增高。同時,觀察比較了NPTX2高甲基化在胰腺癌各階段的表達倍數(shù)變化,發(fā)現(xiàn)隨著美國癌癥聯(lián)合會(American Joint Committee on Cancer,AJCC)TNM分期的進展,該基因甲基化的水平隨之顯著升高,在胰腺癌進展期尤為顯著。緊接著,Zhang等[32-33]證實了NPTX2在胰腺癌中的低表達與其啟動子區(qū)域的高甲基化聯(lián)系緊密,并且指出NPTX2作為一種抑癌基因,能夠使細胞G0/G1期阻滯,促進細胞凋亡,抑制細胞侵襲、轉(zhuǎn)移。

篩選出一個有助于胰腺癌早期診斷的基因甲基化位點,須滿足以下幾項基本條件[34-35]:①在胰腺癌細胞中,候選基因同時發(fā)生異常甲基化和異常表達;②候選基因大部分在胰腺癌的早期發(fā)生異常甲基化;③在正常胰腺細胞中,候選基因能夠正常表達,同時該基因啟動子區(qū)處在低甲基化或者非甲基化的狀態(tài)。與此同時,基因的異常甲基化易于在臨床常規(guī)檢查樣本中(如血尿糞、細胞組織活檢標本等)檢測出來,這也是候選基因篩選的一項必要條件[36]。NPTX2的CpG區(qū)高甲基化有望成為早期胰腺癌初篩的分子標志物和治療靶點。目前,甲基化檢測實驗得到了臨床試驗的評估,主要通過甲基化特異PCR法對有家族病史的胰腺癌患者的胰液進行檢測,但該實驗的敏感性和準確性未經(jīng)證實。所以,對于NPTX2基因的甲基化檢測的敏感性及特異性,有待技術的改進,做進一步的研究考證。

針對DNA甲基化是一種發(fā)生在腫瘤早期、多發(fā)及可逆的遺傳表觀學改變,先前Sato等[11]通過一種甲基化酶抑制劑5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-Aza-dC),又名地西他濱,處理了3種胰腺癌細胞系(AsPC1、PanC1、MiaPaCa2),隨后發(fā)現(xiàn)NPTX2基因的表達明顯增高?？梢?抑制甲基化的過程可在某種程度上恢復抑癌基因NPTX2的表達活性,這也為早期胰腺癌的分子靶向治療提供了新的思路。

4 結論和展望

綜上,NPTX2作為一種胰腺癌的抑癌基因,該基因的表達異?？赡芘c異常DNA甲基化有關。廣泛研究發(fā)現(xiàn),DNA高甲基化抑制了NPTX2基因的表達,促進了胰腺癌的發(fā)生發(fā)展。同時,DNA異常甲基化被證實是一種可逆的表觀遺傳改變,能夠通過抑制甲基化的過程來激活被沉默的抑癌基因。對于NPTX2基因DNA異常甲基化的研究,將會為胰腺癌的早期診斷、靶向治療以及預防提供新的研究領域。目前,盡管證實了NPTX2基因異常甲基化參與胰腺癌發(fā)病進展,但是該基因在胰腺癌中所調(diào)控的通路仍不得而知,需要通過基礎實驗進一步闡明其在致癌過程中確切的分子機制。同時,其甲基化檢測在臨床中的應用還有待于進一步證實。因此,有必要對NPTX2基因的DNA異常甲基化在胰腺癌中的調(diào)控機制做更為深入的研究。