MHC單倍體型無(wú)特定病原體鴨的培育*

王興童 孟 興 佟相慧 陳洪巖 韓凌霞

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)團(tuán)隊(duì)，獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150069)

近交系實(shí)驗(yàn)動(dòng)物因其遺傳物質(zhì)高度純合，生物學(xué)特性和免疫學(xué)水平穩(wěn)定，試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定，是開(kāi)展生命科學(xué)和比較醫(yī)學(xué)研究的良好實(shí)驗(yàn)材料，但是目前真正能滿足市場(chǎng)化供應(yīng)的近交系實(shí)驗(yàn)動(dòng)物只有小鼠和大鼠，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源匱乏，極大阻礙了生命科學(xué)研究進(jìn)展。主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex, MHC)是廣泛存在于脊椎動(dòng)物染色質(zhì)中的一個(gè)緊密連鎖、編碼多個(gè)免疫相關(guān)蛋白的基因簇。其核心基因的高度多態(tài)性與自身免疫病和有遺傳性相關(guān)的腫瘤免疫研究密切相關(guān)，是免疫遺傳學(xué)研究的重要靶基因簇。單倍體型(haplotype)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳特征介于近交系和封閉群之間，特定基因組片段純合的單倍體型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，是現(xiàn)階段實(shí)驗(yàn)動(dòng)物培育的重要方向。

無(wú)特定病原體(Specific pathogen free, SPF)鴨是重要的高等級(jí)禽類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在禽病學(xué)、比較免疫學(xué)和水禽病的防控研究中發(fā)揮重要作用。中國(guó)和歐美都已培育成功并廣泛使用多個(gè)單倍體型SPF雞，但尚無(wú)單倍體型SPF鴨的報(bào)道。國(guó)家禽類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心以地方品種紹興麻鴨 (Anasplatyrhynchosdomestica) 白殼I號(hào)為基礎(chǔ)經(jīng)過(guò)屏障環(huán)境下的正壓隔離器飼養(yǎng)、物流人流阻斷污染途徑、飲用酸化水、飼喂60Co輻射無(wú)菌飼料等生物學(xué)凈化，以閉鎖群方式繁殖，實(shí)現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化，命名為HBK-SPF鴨。經(jīng)過(guò)6個(gè)世代的封閉繁育后，偏離Hardy-Weinberg平衡的位點(diǎn)減少，以等位基因數(shù)目為標(biāo)志的群體遺傳多樣性下降，近交程度呈上升趨勢(shì)，但群體的雜合度相對(duì)穩(wěn)定。經(jīng)過(guò)分子遺傳學(xué)分析[1]、組織學(xué)分析[2]、疫病敏感性試驗(yàn)[3]、細(xì)胞遺傳學(xué)分析[4]、解剖學(xué)數(shù)據(jù)測(cè)定[5]和生理生化數(shù)據(jù)[6]等多項(xiàng)生物學(xué)特性測(cè)定，已成為成熟、穩(wěn)定的SPF鴨群，在禽流感疫苗的研制中發(fā)揮了無(wú)法替代的作用[7-13]。

鴨Tap1和Tap2兩個(gè)拷貝基因轉(zhuǎn)錄方向相反，Tap2毗鄰鴨MHC I類分子重鏈編碼基因UAA[14]。前期研究中，利用位于Tap基因的短串聯(lián)重復(fù)序列(Short tandem repeat, STR)多態(tài)性，在HBK-SPF鴨群檢測(cè)到4種純合基因型，以此建立了4個(gè)MHC單倍體型，分別稱為B1、B2、B3和B4[15]。為了檢測(cè)4個(gè)品系的遺傳穩(wěn)定性，在連續(xù)4個(gè)世代分別開(kāi)展了短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)、基于Tap2 基因的肽結(jié)合區(qū)序列以及基于Tap2 全基因組序列的分子遺傳學(xué)分析，為MHC單倍型鴨群的遺傳質(zhì)量監(jiān)測(cè)提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

國(guó)家禽類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心培育并保存的無(wú)特定病原體MHC單倍型 B1、B2、B3和B4 鴨(生產(chǎn)許可證編號(hào)為SCXK(黑)2011-007，使用許可證編號(hào)為SYXK(黑) 2011-022)。從出雛到淘汰，終生生活在正壓鴨專用隔離器，每日限飼60Co輻照滅菌飼料，飲水為酸化水，自由飲用。

1.2 樣品的制備及引物設(shè)計(jì)

無(wú)菌配制5% 檸檬酸鈉溶液，翅靜脈采集被檢鴨抗凝血。利用Omega Blood DNA Kit提取鴨外周血基因組總DNA，或者利用AxyPrepTMMultisource Total RNA Miniprep Kit提取鴨外周血總 RNA，Prime ScriptTMII1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照產(chǎn)品說(shuō)明書，利用Nano Drop ND-1000濃度測(cè)定儀測(cè)定樣本質(zhì)量，濃度及純度符合A260/A280=1.8～2.0的，-20 ℃?zhèn)浯妗z測(cè)所用的引物信息見(jiàn)表1，由哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司合成。

表1 PCR引物序列及產(chǎn)物信息Table 1 Information of primers and amplicon

1.3 F1代鴨Tap1基因組的短重復(fù)序列分型檢測(cè)

以F1代鴨的血液基因組DNA為模板，按照篩選F0代種鴨的方法，根據(jù)鴨Tap1基因組序列(登錄號(hào)為AY885227)中的短重復(fù)序列位點(diǎn)A(在MHC I區(qū)域的位置見(jiàn)圖1)進(jìn)行分型。圖1中 UXA為MHC I類分子重鏈的編碼基因。B1、B2、B3和B4鴨各12羽、5羽、5羽和4羽。PCR反應(yīng)體系為10× Taq buffer 2.0 μL，dNTP(2.5 mmol/μL)1. 0 μL, 引物AF1和AR1 (10 μmol/L) 各0.3 μL, 模板DNA (50 ng/μL)1.0 μL，Taq polymerase(2.5 U/μL)0.3 μL，加去離子水至20 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，59.4 ℃ 30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；最后再72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中電泳，分子量大小正確的送哈爾濱博仕生物公司測(cè)序。利用MEGA 6.0對(duì)序列結(jié)果與NCBI公布的AY885227和F0代鴨同時(shí)比較。

圖1 位點(diǎn)A與鴨MHC I分子重鏈編碼基因的相對(duì)位置示意圖[15]注：A表示短重復(fù)序列，箭頭表示轉(zhuǎn)錄方向Fig.1 The diagram of short tandem repeat sequence A with genes coding MHC I molecule heavy strainNote：A indicates a short repeat, and the arrow indicates the direction of transcription

1.4 F2代鴨TAP2 編碼區(qū)的同源性分析

以F2代B1、B2、B3鴨3羽、10羽和4羽的血液基因組RNA為模板，設(shè)計(jì)并合成鴨 TAP2蛋白編碼區(qū)特異性引物DuTAP2-F和DuTAP2-R，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。按常規(guī)方法反轉(zhuǎn)錄。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃ 變性 45 s，68 ℃退火2.5 min，循環(huán) 35 次；72 ℃延伸 10 min。針對(duì)Tap2基因組高變區(qū)設(shè)計(jì)并合成引物TAP-4(F)和TAP-4(R)，對(duì)F2代B4鴨18羽進(jìn)行PCR擴(kuò)增。取3 μL PCR 產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳，分子量大小正確的送哈爾濱博仕生物公司測(cè)序。

1.5 F3代鴨Tap2基因組序列的基因型分析

以F3代B2和B4鴨14羽和13羽的血液基因組DNA為模板，針對(duì)TAP2基因組序列的1nt-663 nt，設(shè)計(jì)鑒別引物D-TAP2-dF和D-TAP2-dR，見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取3 μL PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，分子量大小正確的送哈爾濱博仕生物公司測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 F1代單倍型鴨的檢測(cè)

根據(jù)序列比對(duì)結(jié)果，B1、B2、B3和B4鴨都存在短重復(fù)序列A位點(diǎn)，核心重復(fù)結(jié)構(gòu)為GT，分別為(GT)14、(GT)11、(GT)9和(GT)17，各品系內(nèi)在重復(fù)結(jié)構(gòu)上游的108 nt區(qū)域(藍(lán)色下劃線)完全一致，且與F0代種鴨(圖中以B1 TAP1 gene表示，B2、B3和B4略同)分別完全同源；在下游的127 nt區(qū)域(綠色下劃線)，除B2內(nèi)部及與F0代完全同源外，F(xiàn)1代的B1、B3和B4 分別出現(xiàn)12、6和10個(gè)堿基變異，每個(gè)位點(diǎn)都有2種等位基因。結(jié)果見(jiàn)圖2，數(shù)字表示F1代鴨的個(gè)體編號(hào)。

2.2 F2代單倍型鴨的檢測(cè)

根據(jù)Tap2完整編碼區(qū)和1～640 nt的高變區(qū)序列比對(duì)結(jié)果，表明F2代 3個(gè)B1系鴨(圖3中編號(hào)為4 113、4 124、41 34)品系內(nèi)部完全一致，與F0代完全同源；10個(gè)B2系鴨(4 106、4 107、4 109、4 112、4 118、4 136、4 137、4 138、4 140和4 937)只在625位出現(xiàn)A和G 兩種等位基因(圖3中藍(lán)色框圖部分)。1～960nt區(qū)域的序列比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖3。

4個(gè)B3系鴨(編號(hào)為220、222、223、224)在1～640 nt的Tap2高變區(qū)呈高度多樣性，有24個(gè)位點(diǎn)存在2個(gè)等位基因，而B1、B2和B4均為單態(tài)。B3系鴨突變位點(diǎn)的基因型見(jiàn)表2。4個(gè)品系之間表現(xiàn)出明顯的型特異性。

2.3 F3代單倍型鴨的遺傳學(xué)分析

對(duì)F3代B2和B4鴨的Tap2 基因組1～663 nt的核苷酸序列與F0代進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果100%同源。

表2 F2代鴨TAP2 CDS區(qū)1～960 nt的突變位點(diǎn)及其等位基因Table 2 Mutation and alleles of Tap2 CDS 1-960 nt region of F2 haplotype ducks

3 討論

MHC區(qū)域是有頜生物基因組具有高度多樣性的區(qū)域，其基因緊密連鎖，是MHC單倍型建立的理論基礎(chǔ)。SPF鴨最初利用具有多態(tài)性的短重復(fù)序列作為MHC單倍型的分子標(biāo)記，具體是根據(jù)上游108 nt、(GT)結(jié)構(gòu)的重復(fù)數(shù)量以及下游127 nt的單核苷酸多態(tài)性，篩選出4種單倍型的F0代種鴨。為了檢測(cè)此單倍型鴨的遺傳穩(wěn)定性，在后續(xù)連續(xù)3個(gè)世代，分別針對(duì)多樣性更高的Tap2 基因或基因組序列進(jìn)行了遺傳學(xué)分析。

比對(duì)結(jié)果表明，雖然F1代B系鴨的短重復(fù)區(qū)序列及其上游側(cè)翼序列與F0代完全同源，但在下游的127 bp內(nèi)，各品系都存在多個(gè)變異，且都有2個(gè)等位基因，表明根據(jù)A位點(diǎn)確定的純合個(gè)體在與其毗鄰的Tap2基因內(nèi)還具有多態(tài)性。SPF鴨育種部門根據(jù)本檢測(cè)結(jié)果，將全部被測(cè)序列都同源的個(gè)體進(jìn)行選育，剔除了下游存在多態(tài)性的個(gè)體。

在利用Tap2基因組序列對(duì)F2代的遺傳學(xué)檢測(cè)中，B1和B2系鴨已實(shí)現(xiàn)完全純合，但B3鴨出現(xiàn)24個(gè)變異點(diǎn)，且皆為2個(gè)等位基因。因此推測(cè)B3系鴨可能存在2種等位基因型。我們根據(jù)序列比對(duì)結(jié)果，將B3鴨分為B3-1和B3-2個(gè)亞群，分別保存、選育。

再次同時(shí)為了驗(yàn)證B2和B4系鴨的純合型，在對(duì)F3代遺傳學(xué)檢測(cè)時(shí)，另外設(shè)計(jì)引物針對(duì)高變區(qū)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明未再出現(xiàn)變異，說(shuō)明B2和B4已實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定性純合。

眾所周知，動(dòng)物的MHC的單倍型，包括Tap基因的等位基因型，與動(dòng)物的多種疫病敏感性密切相關(guān)[16-18]。同樣，鴨的MHC單倍型也影響著不同品系鴨對(duì)禽流感[19]和鴨瘟[20]的致病性。本研究所選育的單倍型鴨，對(duì)F1代鴨人工感染鴨I型肝炎病毒，結(jié)果B2系鴨的死亡率(36%)明顯低于其他3個(gè)單倍型(73%～93%)[21]。利用表達(dá) H5N1亞型禽流感病毒HA基因重組鴨瘟活載體疫苗免疫F2 代HBK-SPF雛鴨，9周的觀察中， B3系SPF 鴨的血凝抑制(HI)抗體效價(jià)始終顯著高于其它3個(gè)品系[22]。這些結(jié)果都暗示了鴨MHC可能影響了病原微生物對(duì)鴨病的致病性。

本研究為培育水禽疾病防控專用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物提供了依據(jù)。