SPF級實(shí)驗(yàn)小鼠4種致病菌多重PCR方法的建立及優(yōu)化*

張越華 鄭秀青

(廈門大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，廈門 361100)

實(shí)驗(yàn)動物廣泛地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物、公共衛(wèi)生、食品、國防和軍事科學(xué)方面等領(lǐng)域，其質(zhì)量直接影響到我們的生產(chǎn)和生活質(zhì)量。近幾年來隨著實(shí)驗(yàn)動物的需求量與飼養(yǎng)規(guī)模日益擴(kuò)大，檢測數(shù)量也隨之大大增加，任務(wù)越來越繁重[1-4]。鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium，SE)、肺炎克雷伯桿菌(Klebsiellapneumoniae，KPN)、嗜肺巴斯德菌(Pasteurellapneumotropica，PP)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)是造成SPF實(shí)驗(yàn)小鼠污染的常見致病菌，這些致病菌可引起嚙齒類等哺乳動物呼吸系統(tǒng)的隱性感染甚至死亡，在實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量檢測工作中時有陽性結(jié)果的發(fā)生，對動物質(zhì)量的控制造成困擾[5-6]。目前屏障環(huán)境實(shí)驗(yàn)動物微生物檢驗(yàn)檢疫主要依據(jù)中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)《實(shí)驗(yàn)動物微生物學(xué)等級及監(jiān)測》(GB14922.2-2001)的檢驗(yàn)流程進(jìn)行操作，其本質(zhì)上主要依靠傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)鑒定方法，不僅耗時長、花費(fèi)大、特異性低，而且無法對人工難以培養(yǎng)的致病細(xì)菌進(jìn)行檢測。但PCR方法可以彌補(bǔ)細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)的不足，并可在數(shù)小時內(nèi)檢測出病原菌，尤其是多重PCR方法既能節(jié)省試劑用量又能縮短檢測時間。而目前，這四種SPF實(shí)驗(yàn)小鼠常見致病菌的檢測主要依賴于單一的PCR檢測[7-8]，同時檢測該四種病原微生物的多重PCR的方法尚未建立，本研究旨在建立一種能同時檢測鼠傷寒沙門氏菌、肺炎克雷伯桿菌、嗜肺巴斯德菌、銅綠假單胞菌的多重PCR方法，為其在SPF級實(shí)驗(yàn)小鼠微生物檢測應(yīng)用中提供良好的檢測手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試菌株： 標(biāo)準(zhǔn)菌株：實(shí)驗(yàn)菌株為鼠傷寒沙門氏菌CMCCCB50115、肺炎克雷伯桿菌ATCC700603、嗜肺巴斯德菌ATCC35149、銅綠假單胞菌ATCC27853由廈門大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心質(zhì)檢部保存以及提供。

1.1.2培養(yǎng)基及試劑： 營養(yǎng)肉湯購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；Taq DNA聚合酶、 dNTPS、DNA Marker購自寶生物工程(大連)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒采購于廈門艾碧康生物科技有限公司；瓊脂糖購自上海生工生物工程股份有限公司；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；其他試劑均為市售分析純試劑。

1.1.3主要儀器設(shè)備： T100 Thermal Cycler PCR儀、PowerPac電泳儀(美國Bio-Rad公司)，凝膠成像系統(tǒng)。

1.1.4實(shí)驗(yàn)動物： 42只18～22 g雄性SPF級KM小鼠，來源于廈門大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心合格證號：【SCXK(閩)2013-0001】,并飼養(yǎng)在該中心ABSL-2生物安全實(shí)驗(yàn)室負(fù)壓IVC中，其感染過程在生物安全柜內(nèi)操作。

1.2 方法

1.2.1細(xì)菌DNA提?。?所有菌株分別接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，按試劑盒說明書要求提取細(xì)菌DNA基因組，采用紫外分光光度計測定模板DNA的濃度與純度，將獲得的DNA樣品于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2多重PCR引物設(shè)計與合成： 選擇鼠傷寒沙門氏菌invA基因、肺炎克雷伯桿菌khe基因、嗜肺巴斯德菌16SrRNA基因、銅綠假單胞菌ecfX基因作為特征靶基因，應(yīng)用Primer premier 5.0及Oligo 6.0軟件設(shè)計4對特異性引物,并由上海生工生物工程股份有限公司合成，其序列見表1。

表1 靶基因與引物序列Table 1 Target gene and primer sequences

1.2.3單重PCR檢測方法的建立：為了確定單重PCR擴(kuò)增的最佳條件及檢測單基因PCR擴(kuò)增的特異性，分別以4個標(biāo)準(zhǔn)菌的DNA為模板，用相應(yīng)的引物進(jìn)行單重PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：2 μL模板DNA，0.5 μL 50 μmol/L上、下游引物，4 μL 2.5 mmol/L dNTPs，1.5 μL 1 mol/L MgCl2，Taq酶2.5 U，5 μL 10×PCR buffer，加ddH2O至50 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。其次為了摸索不同退火溫度的影響，將退火溫度設(shè)定為：45.8 ℃、48.4 ℃、51.5 ℃、54.0 ℃、56.8 ℃、59.5 ℃、62.1 ℃、64.5 ℃，進(jìn)行PCR反應(yīng)，以確定單項PCR反應(yīng)的最佳退火溫度。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4多重PCR反應(yīng)條件優(yōu)化：以鼠傷寒沙門氏菌、肺炎克雷伯桿菌、嗜肺巴斯德菌、銅綠假單胞菌混合DNA為模板，以等量添加不同標(biāo)準(zhǔn)菌的引物對為原則，優(yōu)化多重PCR的反應(yīng)條件。初始反應(yīng)體系為：5 μL 10×PCR buffer，1.5 μL 1 mol/L MgCl2，4 μL 2.5 mmol/L dNTPs，2.0 μmol/L 4對引物各1.0 μL，Taq酶2.5 U，加ddH2O至50 μL。對多重PCR的退火溫度、引物濃度和Mg2+濃度 進(jìn)行優(yōu)化。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5多重PCR反應(yīng)特異性試驗(yàn)： 分別以4種細(xì)菌基因組DNA的混合樣本、單一樣本及其他陰性菌的DNA樣本為模板，同時加入4對引物，用優(yōu)化后的反應(yīng)體系及條件進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增。

1.2.6多重PCR反應(yīng)敏感性試驗(yàn)： 將提取的4種標(biāo)準(zhǔn)菌的DNA模板濃度稀釋至100 ng/μL濃度。按100～10-9ng/μL梯度進(jìn)行倍比稀釋，以優(yōu)化后的多重PCR條件進(jìn)行擴(kuò)增，測定多重PCR反應(yīng)的靈敏性。

1.2.7多重PCR的初步應(yīng)用： 42只4周齡昆明小鼠被隨機(jī)分為7組(1～7)，每組6只，分別腹腔注射鼠傷寒沙門氏菌(0.5 mL)；銅綠假單胞菌(0.5 mL)；肺炎克雷伯桿菌+嗜肺巴斯德菌+銅綠假單胞菌+鼠傷寒沙門氏菌(每種菌0.12 mL)；嗜肺巴斯德菌+銅綠假單胞菌(每種菌0.25 mL)；鼠傷寒沙門氏菌+銅綠假單胞菌(每種菌0.25 mL)；嗜肺巴斯德菌+ 鼠傷寒沙門氏菌+肺炎克雷伯桿菌(每種菌0.17 mL)；另設(shè)生理鹽水(0.5 mL)作為陰性對照組。7組小鼠飼養(yǎng)在ABSL-2生物安全實(shí)驗(yàn)室負(fù)壓IVC內(nèi)，并在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行感染操作。觀察其發(fā)病及死亡情況，飼養(yǎng)10 d后，將7組小鼠解剖，無菌采集其肝、肺、腸等部位，并置于肉湯中進(jìn)行過夜培養(yǎng)，所獲得的菌液作為模板，按照前述提取細(xì)菌DNA，采用已優(yōu)化好的多重PCR方法進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 單重PCR擴(kuò)增結(jié)果

分別以SE、KPN、PP、PA的基因組DNA為模板，在不同的退火溫度下進(jìn)行單一PCR反應(yīng)。凝膠電泳檢測結(jié)果顯示：在不同的退火溫度下，SE、KPN、PP、PA均能擴(kuò)增出相應(yīng)分子量大小的目的片段(分別為284 bp、428 bp、198 bp和528 bp)，且無其他非特異性條帶，其中嗜肺巴斯德桿菌和綠膿桿菌在退火溫度高于59.5 ℃時擴(kuò)增效率降低，片段變?nèi)酰痪G膿桿菌則在低于54.0 ℃擴(kuò)增效率降低；而對另外兩種菌的擴(kuò)增效率無明顯影響。因此最終確定單基因PCR擴(kuò)增的最佳退火溫度為 54.0～59.5 ℃(圖1)。

圖1 單重PCR擴(kuò)增及退火溫度的優(yōu)化注：M：DL2000 marker；1～8肺炎克雷伯桿菌；9～16嗜肺巴斯德菌；17～24綠膿桿菌；25～32鼠傷寒沙門氏菌；退火溫度從1～8，9～16，17～24，25～32依次為45.8 ℃， 48.4 ℃， 51.5 ℃， 54.0 ℃， 56.8 ℃， 59.5 ℃， 62.1 ℃， 64.5 ℃Fig.1 Single PCR products and optimal annealing temperatureNote：M： DNA Marker DL2000；1-8 Klebsiella Pneumoniae；9-16 Pasteurella pneumotropica；17-24 Pseudomonas Aeruginosa；25-32 Salmonella typhimurium; Annealing temperatures were 45.8 ℃, 48.4 ℃,51.5 ℃, 54.0 ℃, 56.8 ℃, 59.5 ℃, 62.1 ℃, 64.5 ℃.

2.2 多重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

以SE、KPN、PP、PA的混合DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，分別對多重PCR的退火溫度、引物濃度和Mg2+濃度進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，退火溫度在59.5～64.5 ℃時，4條目的條帶均最清晰，確定為最佳溫度范圍(見圖2)；引物濃度在5～10 pmol/μL時最佳(見圖3)；Mg2+濃度在2～4 m mol/L時最佳(見圖4)。因此，確定同時檢測4種目的菌的多重PCR方法的最佳反應(yīng)體系如下：10×PCR buffer 5 μL，3 μL MgCl2(1 mol/L)，2 μL dNTP(2.5 mmol/L)，2.0 μmol/L 4對引物各0.75 μL，Taq酶1 U，加ddH2O至50 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，62.1 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，34個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。此優(yōu)化后的多重PCR反應(yīng)體系在后續(xù)的特異性實(shí)驗(yàn)中得到進(jìn)一步的驗(yàn)證，如圖5(B)。

圖2 多重PCR退火溫度優(yōu)化注：M：DL2000 marker；1 陰性對照；2～9退火溫度依次為64.5 ℃、62.1 ℃、59.5 ℃、56.8 ℃、54.0 ℃、51.5 ℃、48.4 ℃、45.8 ℃Fig.2 The optimal annealing temperature in multiplex PCRNote：M：DNA Marker DL2000；1 Negtive control； 2-9 Annealing temperatures were 64.5 ℃, 62.1 ℃, 59.5 ℃, 56.8 ℃,54.0 ℃ 51.5 ℃, 48.4 ℃, 45.8 ℃

圖3 多重PCR引物濃度優(yōu)化注：M：DL2000 marker；1:陰性對照；2～8：不同引物濃度優(yōu)化，引物濃度依次為35、20、15、10、8、5、2 pmol/μLFig.3 The optimal primer concentration used in multiplex PCRNote：M：DNA Marker DL2000；1：Negtive contral；2-8: Primers concentrations were 35, 20, 15, 10, 8, 5, 2 pmol/μL

2.3 多重PCR的特異性

圖4 多重PCR 鎂離子濃度優(yōu)化注： M：DL2000 marker；1:陰性對照；2～9：不同Mg2+濃度依次為5、4.5、4、3.5、3、2、1、0.5 mmol/LFig.4 The optimal Mg2+ concentration used in multiplex PCRNote:DNA Marker DL2000；1：Negtive contral；2-9: Mg2+concentration were 5, 4.5, 4, 3.5, 3, 2, 1, 0.5 mmol/L

分別對SE、KPN、PP、PA的基因組DNA混合模板、單一模板、其他陰性菌模板及空白對照進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖5。由圖可知，所建立的PCR能有效地同時檢測本研究所涉及的4種致病菌中的一種或多種，表明所建方法特異性良好。

圖5 多重PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果 圖5(A)M：DL2000 Marker；1：嗜肺巴斯德菌、鼠傷寒沙門氏菌、肺炎克雷伯桿菌、 綠膿桿菌四種菌模板；2：鼠傷寒沙門氏菌、肺炎克雷伯桿菌、綠膿桿菌三種菌模板；3：嗜肺巴斯德菌、肺炎克雷伯桿菌、 綠膿桿菌三種菌模板；4：嗜肺巴斯德菌、鼠傷寒沙門氏菌、 綠膿桿菌三種菌模板；5：嗜肺巴斯德菌、鼠傷寒沙門氏菌、肺炎克雷伯桿菌三種菌模板；6：肺炎克雷伯桿菌、 綠膿桿菌兩種菌模板；7：鼠傷寒沙門氏菌、 綠膿桿菌兩種菌模板；8：鼠傷寒沙門氏菌、肺炎克雷伯桿菌兩種菌模板；9：嗜肺巴斯德菌、 綠膿桿菌兩種菌模板；10：嗜肺巴斯德菌、肺炎克雷伯桿菌兩種種菌模板；11：嗜肺巴斯德菌、鼠傷寒沙門氏菌兩種菌模板；12：綠膿桿菌單模板；13：肺炎克雷伯菌單模板；14：鼠傷寒沙門氏菌單模板；15：嗜肺巴斯德菌單模板；16：陰性對照；圖5(B)M：DL2000 Marker；1：金黃色葡萄球菌；2:肺炎鏈球菌；3：乙型溶血性鏈球菌；4：李斯特桿菌；5：支氣管鮑特桿菌；6:鼠棒狀桿菌；7：大腸埃希桿菌；8：志賀桿菌；9：嗜肺巴斯德菌、沙門氏菌、肺炎克雷伯桿菌、 綠膿桿菌Fig.5 The specificity of multiplex PCR A：DNA Marker DL2000; 1: Pasteurella pneumotropica,Salmonella typhimurium, Klebsiella Pneumoniae, Pseudomonas Aeruginosa mix template;2: Salmonella typhimurium, Klebsiella Pneumoniae, Pseudomonas Aeruginosa mix template; 3: Pasteurella pneumotropica, Klebsiella Pneumoniae, Pseudomonas Aerugino mix template; 4: Pasteurella pneumotropica, Klebsiella Pneumoniae, Pseudomonas Aeruginosa mix template;5:Pasteurella pneumotropica，Salmonella typhimurium，Klebsiella Pneumoniae mix template; 6:Klebsiella Pneumoniae，Pseudomonas Aeruginosamix template; 7:Salmonella typhimurium， Pseudomonas Aeruginosa mix template; 8:Salmonella typhimurium, Klebsiella Pneumoniae mix template;9:Pasteurella pneumotropica，Pseudomonas Aeruginosa mix template; 10:Pasteurella pneumotropica，Klebsiella Pneumoniae mix template;11: Pasteurella pneumotropica,Salmonella typhimurium mix template; 12:Pseudomonas Aeruginosa template; 13:Klebsiella Pneumoniae template;14:Salmonella Spp template; 15:Pasteurella pneumotropica template; 16:Negative control B：DNA Marker DL2000; 1:Staphylococcus aureus； 2:Streptococcus pneumonia； 3:Beta hemolytic streptococcus； 4:Liszt bacillus；5:Bordetella bronchiseptica； 6:Corynebacterium kutscheri； 7:Escherichia coli； 8:Shiga bacillus； 9: Pasteurella pneumotropica,Salmonella typhimurium, Klebsiella Pneumoniae, Pseudomonas Aeruginosa

2.4 多重PCR的敏感性

將相同濃度的4種菌混合后10倍梯度稀釋，采用已經(jīng)優(yōu)化好的多重PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果表明，所建立的多重PCR對鼠傷寒沙門氏菌、肺炎克雷伯桿菌、嗜肺巴斯德菌、銅綠假單胞菌最低檢出量分別為 10-5、10-4、10-3、10-4ng/μL，可得到多重PCR的最低檢出量為10-3ng/μL，見圖6。

圖6 多重PCR靈敏性檢測注：M：DL2000 Marker；1～10依次模板濃度為：100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9ng/μLFig.6 The sensitivity test of the multiplex PCRNote：DNA Marker DL2000；1-10 Primer concentration were 100, 10-1, 10-2, 0-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9ng/μL

2.5 多重PCR的初步應(yīng)用

采用4種致病菌單一或者混合感染昆明小鼠，其中細(xì)菌感染組的小鼠在24～72 h內(nèi)均有2～3只死亡，及時將其裝入無菌封口袋后放入-20 ℃冰箱保存，而生理鹽水對照組的小鼠全部存活。試驗(yàn)結(jié)束后將剩余存活的動物采樣后處以二氧化碳安死術(shù)，無菌操作獲取小鼠肝、肺、腸等組織后進(jìn)行肉湯培養(yǎng)并提取DNA，按照已優(yōu)化好的多重PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果如圖7：每份細(xì)菌感染組的樣本均擴(kuò)增出了對應(yīng)的特異條帶，而生理鹽水對照組無擴(kuò)增條帶，證明建立的多重PCR方法可應(yīng)用于臨床檢測，見圖7。

圖7 人工模擬試驗(yàn)多重PCR檢測結(jié)果注：M：DL2000 Marker；1～3、22～24： 陰性對照；4～6：鼠傷寒沙門氏菌；7～9：綠膿桿菌；10～12：嗜肺巴斯德菌、鼠傷寒沙門氏菌、肺炎克雷伯桿菌、 綠膿桿菌四種菌；13～15：嗜肺巴斯德和綠膿桿菌；16～18：鼠傷寒沙門氏菌和綠膿桿菌；19～21：嗜肺巴斯德菌、鼠傷寒沙門氏菌、肺炎克雷伯桿菌三種菌Fig.7 The artificial simulation test of the multiplex PCR assayNote：DNA Marker DL2000；1-3, 22-24: Negtive contral；4-6: Salmonella typhimurium；7-9: Pseudomonas Aeruginosa；10-12: Pasteurella pneumotropica,Salmonella typhimurium,Klebsiella Pneumoniae and Pseudomonas Aeruginosa；13-15: Pasteurella pneumotropica and Pseudomonas Aeruginosa；16-18: Salmonella typhimurium and Pseudomonas Aeruginosa；19-21: Pasteurella pneumotropica,Salmonella typhimurium and Klebsiella Pneumoniae

3 討論

多重PCR能夠在一個反應(yīng)體系中同時檢測多種病原微生物，以其快速、準(zhǔn)確、低成本等優(yōu)勢在多個檢測領(lǐng)域中得到廣泛的應(yīng)用，尤其在實(shí)驗(yàn)動物的微生物質(zhì)量控制過程中，具有極高的應(yīng)用價值。然而，多重PCR并不是單純的混合體系反應(yīng)，在檢測過程中會受到多種因素的制約影響:首先，引物設(shè)計是多重PCR反應(yīng)是否成功的關(guān)鍵[9]，各引物對必須高度特異，避免非特異擴(kuò)增。本研究在前人單重PCR研究的基礎(chǔ)上，選取編碼鼠傷寒沙門氏菌侵襲蛋白的invA基因[10]、編碼肺炎克雷伯桿菌體外溶血酵素的khe基因[11]以及銅綠假單胞菌的內(nèi)標(biāo)基因Ecfx基因[12]和嗜肺巴斯德的16SrRNA基因[13]作為目的基因，在其高度保守區(qū)設(shè)計引物，建立多重PCR體系,結(jié)果顯示所設(shè)計多對引物的特異性較好；其次，退火溫度、引物濃度、鎂離子濃度等為影響PCR的重要因素，多重PCR體系由于存在多對引物、多個模板因而更加復(fù)雜，基于此，本研究通過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化多重PCR反應(yīng)的條件后，最終確定多重PCR的最佳退火溫度為59.5 ℃，最佳引物濃度6 pmol/μL，最佳鎂離子濃度3 mmol/L;此外，本實(shí)驗(yàn)中的多重PCR能檢測沙門氏菌、肺炎克雷伯桿菌、嗜肺巴斯德菌、銅綠假單胞菌最低檢出量為10-3ng/μL，說明該方法具有較高的敏感性。在實(shí)際樣本檢測過程中，一般采取適當(dāng)?shù)脑鼍鷣慝@得足量的、雜質(zhì)含量少的菌量，同時降低由于檢測靈敏度較高而擴(kuò)增造成假陽性的可能，本實(shí)驗(yàn)的初步應(yīng)用通過將小鼠的組織樣本浸潤在致病菌相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行過夜振蕩增菌(約16 h)培養(yǎng)獲得足量的菌量，以減少出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

綜上所述，本試驗(yàn)建立的多重PCR方法具有快速、準(zhǔn)確、簡便、靈敏、穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)，具有較高的實(shí)際應(yīng)用價值，為SPF級實(shí)驗(yàn)動物沙門氏菌、肺炎克雷伯桿菌、嗜肺巴斯德菌、銅綠假單胞菌的常規(guī)監(jiān)測、感染早期診斷、新種源引進(jìn)的隔離檢疫等提供了新的快速檢測方法。