兒童慢性乙型肝炎患者HBV前C/基本核心啟動子區(qū)基因變異特點研究

儲 芳，鐘彥偉，楊紅艷，王 丹，溫夢凡，劉 超，孫群蘭，李 晶，張 明，官卉卉，王文波，張 敏

流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，我國1～59歲一般人群HBsAg攜帶率為7.18%，5歲以下兒童的HBsAg攜帶率為0.96%。嬰幼兒時期感染者大約85%～95%不能清除病毒轉(zhuǎn)為慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B, CHB）， 最終可發(fā)展至肝硬化（liver cirrosis, LC）、失代償性肝病甚至肝細(xì)胞癌[1-2]。到目前為止，HBV的致病機(jī)制尚未完全清楚。國內(nèi)外研究表明，乙型肝炎（乙肝）患者HBV前C（procore, PC）和基本核心啟動子（basal core promoter, BCP）區(qū)變異與乙肝重癥化進(jìn)程相關(guān)[3-5]。但對兒童乙肝患者的研究鮮見報道。本研究探討了兒童CHB患者HBV PC/BCP區(qū)變異的特點及臨床特征。

1 對象與方法

1.1 對象 回顧性分析2006年1月—2013年12月在我中心就診的病毒性乙肝患兒166例。年齡1～18歲，其中CHB患兒82例，乙肝相關(guān)LC患兒84例。所有病例診斷符合2015年《慢性乙型肝炎防治指南》，患者排除甲、丙、丁、戊型肝炎病毒及HIV感染，酒精，藥物和自身免疫性肝病所導(dǎo)致的肝功能損害。樣本使用標(biāo)本庫的標(biāo)本。

1.2 HBV DNA的提取 在1.5 ml塑料離心管中加入200 μl患者血清；然后向上述離心管中加入600 μl病毒DNAout溶液，振蕩30 s混勻后室溫放置10 min；再振蕩30 s混勻，加入700 μl異丙醇，振蕩30 s混勻后，15 000×g室溫離心15 min；移棄上清，加入1.0 ml 70%乙醇，振蕩數(shù)秒后，15 000×g室溫離心5 min；移棄上清，加入200 μl超純水，用移液槍仔細(xì)吹打離心管管底和管壁的膜狀沉淀，使其溶解。

1.3 血清學(xué)標(biāo)志物及乙肝五項數(shù)據(jù) 采用患者入院當(dāng)日采集血液樣本并進(jìn)行相關(guān)臨床檢測的數(shù)據(jù)。

1.4 HBV PC/BCP區(qū)擴(kuò)增及序列測定 采用巢式PCR方法擴(kuò)增HBV PC/BCP區(qū)序列[6]，PCR反應(yīng)體系 25 μl。第一輪反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min；94 ℃35 s，59 ℃ 35 s，每2個循環(huán)溫度降低2 ℃，72 ℃ 70 s；30個循環(huán)。第二輪反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 25 s，56 ℃ 25 s，72 ℃ 50 s；35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物純化后直接測序。使用Vector NTI 軟件對測序結(jié)果進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 用SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計量資料首先進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗，當(dāng)數(shù)據(jù)符合正態(tài)性時，采用x±s表示；方差齊性時，組間比較用t檢驗，當(dāng)方差不齊時，組間比較采用t’檢驗；當(dāng)數(shù)據(jù)不符合正態(tài)性時，采用四分位數(shù)表示，組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗。計數(shù)資料采用頻數(shù)或率表示；當(dāng)總樣本量≥40且所有理論頻數(shù)均≥5時，組間比較采用χ2檢驗；當(dāng)總樣本量≥40，但有1≤理論頻數(shù)＜5時，組間比較采用連續(xù)校正χ2檢驗；當(dāng)總樣本量＜40，或有理論頻數(shù)＜1時，組間比較采用Fisher確切概率法。所有統(tǒng)計分析過程均采取雙側(cè)檢驗。 P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

166例患兒中，20.83%為感染HBV B基因型的患兒，79.17%為感染HBV C基因型的患兒。

從表1和表2可以看出，在感染B基因型的患兒中，CHB組和乙肝LC組患兒的ALT水平分別為（111.45±100.18）IU/L和（113.42±138.77）IU/L，2組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。但在感染C基因型的患兒中，CHB組和乙肝LC組患兒的ALT水平分別為（123.43±177.32）IU/L和（252.86±275.86）IU/L，2組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

在感染HBV B基因型的患兒中，CHB組和乙肝LC組患兒相比，HBV DNA水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但后者的G1899A位點突變率高于前者（P＜0.05）。在感染HBV C基因型的患兒中，與CHB組患兒相比，乙肝LC組患兒的HBV DNA水平較低但ALT水平較高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。乙肝LC組患兒發(fā)生A1762T、G1764A、G1896A基因位點的突變率明顯高于CHB組患兒（P均＜0.05）。在感染HBV B和C基因型患兒中，CHB組和乙肝LC組患兒相比，基因位點G1752A、T1753C、T1758C、C1766T、T1768A及G1862T的突變率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。

表1 B基因型CHB和乙肝LC患兒檢測結(jié)果Table 1 Serum examination results of genotype B children with CHB and LC

表2 C基因型CHB 和乙肝LC患兒檢測結(jié)果Table 2 Serum examination results of genotype C children with CHB and LC

3 討 論

HBV感染的結(jié)果取決于病毒、宿主免疫反應(yīng)及環(huán)境因素之間的關(guān)系。當(dāng)出現(xiàn)特殊的HBV變異打破三者之間的平衡，就會改變病毒與宿主之間的關(guān)系，引起肝細(xì)胞炎癥，發(fā)生嚴(yán)重的肝臟疾病。目前，國內(nèi)外文獻(xiàn)對成人CHB患者HBV變異與乙肝重癥化的相關(guān)性研究較多，通常認(rèn)為HBV基因變異導(dǎo)致的病毒生物學(xué)特性改變是影響乙肝患者疾病進(jìn)展的重要因素之一[7-13]。HBV PC/BCP區(qū)變異對HBV的復(fù)制和病毒蛋白的翻譯可產(chǎn)生重要影響，進(jìn)而影響疾病的進(jìn)展[14-20]。但兒童乙肝患者相關(guān)問題的研究報道較少。本研究通過對兒童CHB和乙肝相關(guān)LC患者PC/BCP區(qū)變異特點及臨床特征的比較，探討二者之間的關(guān)系。血清檢測結(jié)果顯示：在感染B基因型的患兒中，CHB組與乙肝LC組患兒的ALT水平相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。但在感染C基因型的患兒中，CHB組與乙肝LC組患兒的ALT水平相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

HBV PC區(qū)最常見的變異通常是1896位點變異，該位點變異可使色氨酸密碼子（TGG）變?yōu)榻K止密碼子（TAG），導(dǎo)致HBeAg合成終止。另外1862和1899位點變異可導(dǎo)致編碼氨基酸改變，從而使HBeAg前體無法被信號酶裂解，對HBeAg的分泌造成影響。HBcAg是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic lymphocyte, CTL）識別和攻擊的主要靶抗原。當(dāng)HBV PC/BCP區(qū)變異引起HBeAg缺失時，CTL對肝細(xì)胞的攻擊活性增強(qiáng)，從而可引發(fā)肝臟免疫性損傷，導(dǎo)致肝臟炎癥病變加劇，疾病重癥化。此外，HBeAg的缺失還可以減弱CTL和Th1的活化誘導(dǎo)性細(xì)胞死亡，引起肝細(xì)胞大量死亡。HBV變異后往往引起抗原性和致病性改變，它既可使肝病加重，又可使病毒逃避機(jī)體免疫而持續(xù)感染。也有研究報道HBV BCP變異患者HBeAg表達(dá)水平降低，其原因為BCP變異可影響肝臟富集轉(zhuǎn)錄因子與BCP區(qū)的結(jié)合，使PC區(qū)mRNA轉(zhuǎn)錄明顯減少，導(dǎo)致HBeAg合成減少[21-22]。最近有研究顯示，T1753C、A1762T、G1764A、C1766T、T1768A、G1862T、G1896A 及 G1899A 位點的突變率隨患者的肝臟炎癥程度呈現(xiàn)上升趨勢，表明這一區(qū)域多位點變異發(fā)生頻率的增加與疾病重癥化進(jìn)程密切相關(guān)[23]。我們的研究結(jié)果顯示感染HBV C基因型患兒，發(fā)生A1762T、G1764A、G1896A位點變異者，肝臟炎癥程度呈現(xiàn)上升趨勢，提示這些位點變異可能與乙肝相關(guān)LC密切相關(guān)。與西方國家乙肝以輸血為主的水平傳播方式不同，我國的CHB患者以母嬰垂直傳播為主，推測PC/BCP區(qū)變異可在長期的HBV感染過程中逐步積累，可能參與乙肝的致病機(jī)制。本研究結(jié)果對于闡明病毒學(xué)因素對兒童CHB患者結(jié)局的影響有重要意義。HBV感染的結(jié)果取決于病毒、宿主免疫反應(yīng)及環(huán)境因素，當(dāng)HBeAg合成或分泌障礙時，病毒與細(xì)胞間的平衡被打破，易引發(fā)宿主更強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致更廣泛的肝細(xì)胞損傷。本研究結(jié)果表明對CHB患兒開展A1762T、G1764A、G1896A位點突變監(jiān)測具有重要意義。