C基因型多重耐藥乙型肝炎病毒穩(wěn)定復(fù)制表達(dá)小鼠模型的建立

劉璐潔，楊 悅，余雙慶，許智慧，趙 麗，劉新光，吳小兵，徐東平，董小巖，劉 妍

多重耐藥乙型肝炎病毒（multidrug resistant hepatitis B virus, MDR HBV）是指HBV基因組同時出現(xiàn)核苷類藥物耐藥突變（rtM204I/V±rt184/202/250變異）和核苷酸類藥物耐藥突變（rtA181V±rtN236T）的病毒[1]。近年來，臨床上耐核苷類藥物和核苷酸類藥物的MDR HBV感染呈逐年增多趨勢，給臨床治療帶來巨大的挑戰(zhàn)[2]。我國HBV感染以B和C基因型流行為主，北方地區(qū)C基因型感染患者高達(dá)83.8%[3]，有研究顯示C基因型HBV感染患者有更高的多重耐藥發(fā)生風(fēng)險和進(jìn)展為肝硬化、肝細(xì)胞癌的風(fēng)險[4]。本課題組前期從我國大樣本來源的慢性HBV感染患者中分離鑒定了16種MDR HBV株，并在國內(nèi)外首次建立了C基因型MDR HBV（HBV基因組反轉(zhuǎn)錄酶區(qū)同時含有如下耐藥位點(diǎn)：rtL180M+S202G+M204V+N236T）穩(wěn)定復(fù)制細(xì)胞系（國家發(fā)明專利ZL201110353756.0），具備了體外細(xì)胞水平研究C基因型MDR HBV的工具[5]。為了能夠深入研究C基因型MDR HBV的體內(nèi)病毒學(xué)特性及優(yōu)化治療方案，需要合適的C基因型MDR HBV動物模型。

由于小鼠易獲得、研究背景清楚、經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)，HBV小鼠模型廣泛應(yīng)用于人HBV相關(guān)研究。但因?yàn)镠BV的種屬特異性，小鼠并不能天然感染HBV，可通過轉(zhuǎn)基因、高壓水動力注射、重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)及人源化人-鼠嵌合肝臟等方法介導(dǎo)，實(shí)現(xiàn)人HBV在小鼠體內(nèi)復(fù)制及人工感染[6]。上述方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，其中重組8型腺相關(guān)病毒（recombinant adeno-associated virus 8, rAAV8）介導(dǎo)的HBV穩(wěn)定復(fù)制表達(dá)小鼠模型具有成模率高、病毒復(fù)制水平高、穩(wěn)定復(fù)制持久等優(yōu)點(diǎn)。本研究擬在前期工作基礎(chǔ)上，建立rAAV8介導(dǎo)的C基因型MDR HBV穩(wěn)定復(fù)制表達(dá)小鼠模型，為后續(xù)評價抗MDR HBV藥物療效提供實(shí)驗(yàn)平臺。

1 材料與方法

1.1 材料 6～8周齡雌性C57BL/6小鼠購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司；人乙肝病毒表面抗原（HBsAg）和E抗原（HBeAg）ELISA檢測試劑盒購自北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司；小鼠抗人乙肝病毒核心抗原（HBcAg）單克隆抗體、小鼠抗人HBsAg單克隆抗體以及生物素-鏈霉素免疫組化檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

本文C基因型野生病毒命名為rAAV8-1.3HBV-C-WT，C基因型多重耐藥病毒命名為rAAV8-1.3HBV-C-MDR。病毒載體構(gòu)建及病毒純化均與北京五加和分子醫(yī)學(xué)研究所有限公司合作完成。

1.2 方法

1.2.1 病毒 rAA V8-1.3HBV-C-MDR和rAA V8-1.3HBVC-WT的制備 首先構(gòu)建攜帶1.3倍C基因型MDR HBV基因組和1.3倍C基因型野生型HBV（wild type HBV, WT HBV）基因組的重組腺相關(guān)病毒質(zhì)粒pAAV2neo-1.3HBV-C-MDR、pAAV2neo-1.3HBV-C-WT，測序鑒定正確后使用腺相關(guān)病毒進(jìn)行包裝純化[7]。每個樣品設(shè)置2個復(fù)孔，按照MOI值（vg/cell）為106的標(biāo)準(zhǔn)，將重組病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)至Huh7細(xì)胞，同時設(shè)不轉(zhuǎn)導(dǎo)病毒的細(xì)胞對照孔作為空白對照孔，檢測上清HBsAg和HBeAg水平。

1.2.2 動物模型的制備 將重組病毒rAAV8-1.3HBV-C-MDR和rAAV8-1.3HBV-C-WT分別經(jīng)尾靜脈注射至C57BL/6小鼠體內(nèi)（注射劑量為1×1011vg/200 μl/只），以建立文獻(xiàn)已報道的C基因型WT HBV復(fù)制小鼠模型（HBV-C-WT組，n=6）和MDR HBV復(fù)制小鼠模型（HBV-C-MDR組，n=6）。病毒注射后第2、3、5、7、9周分別經(jīng)眼底靜脈叢采血，檢測血清中HBV DNA、HBsAg和HBeAg的表達(dá)水平，并于第9周末處死全部小鼠，取肝組織行HE染色和免疫組化染色觀察。以上動物實(shí)驗(yàn)均在原解放軍第三〇二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心完成，飼養(yǎng)條件和實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格遵照美國健康研究所實(shí)驗(yàn)動物護(hù)理與利用指南進(jìn)行。以上實(shí)驗(yàn)經(jīng)該院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2.3 熒光定量PCR檢測血清HBV DNA 病毒注射后第2、3、5、7、9周經(jīng)眼底靜脈叢采血，將采集到的全血置于37 ℃孵箱中溫育1 h，室溫下3000 r/min離心10 min分離血清。取15 μl血清送北京巴奧瑞生物科技有限公司進(jìn)行HBV DNA定量檢測（檢測下限為102IU/ml），每份小鼠血清樣本設(shè)3個復(fù)孔，取均值。

1.2.4 ELISA檢測小鼠血清HBsAg和HBeAg水平 上述步驟中得到的血清經(jīng)生理鹽水稀釋20倍后，使用HBsAg、HBeAg診斷試劑盒檢測小鼠血清HBsAg和HBeAg水平，檢測過程參見試劑盒說明書。2項(xiàng)指標(biāo)陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)均定義為樣品A450值≥臨界值（cutoff值），臨界值=陰性對照孔均值×2.1（陰性對照孔低于0.05者按0.05計(jì)算）。

1.2.5 小鼠肝組織HE染色和免疫組化染色 取小鼠肝臟，用10%多聚甲醛固定，石蠟包埋后切片，行HE染色，診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《慢性乙型肝炎防治指南》[8]。同時進(jìn)行免疫組化染色檢測肝組織HBsAg和HBcAg的表達(dá)，鏡下觀察肝細(xì)胞膜被染為棕黃色表示HBsAg表達(dá)，肝細(xì)胞核被染為棕黃色表示HBcAg表達(dá)，陰性不顯色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料呈正態(tài)分布或近似正態(tài)分布，用x±s表示，2組比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；2組指標(biāo)在不同時間點(diǎn)的比較用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 重組腺相關(guān)病毒質(zhì)粒pAAV2neo-1.3HBV-C-MDR構(gòu)建成功后測序并與C基因型RT區(qū)標(biāo)準(zhǔn)序列比對，可見在同一病毒基因組上出現(xiàn)典型MDR HBV突變位點(diǎn)rtL180M+S202G+M204V+N236T，測序比對分析見圖1。

圖1 重組病毒質(zhì)粒pAAV2neo-1.3HBV-C-MDR中HBV部分反轉(zhuǎn)錄酶區(qū)序列比對分析箭頭標(biāo)注顯示同一病毒基因組上rtL180M、rtS202G、rtM204V和rtN236T同時發(fā)生多重耐藥突變Figure 1 Sequence alignment of HBV partial reverse transcriptase region of recombinant viral plasmid pAAV2neo-1.3HBV-C-MDR

2.2 重組病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)Huh7細(xì)胞中HBsAg和HBeAg的表達(dá) 未轉(zhuǎn)導(dǎo)重組病毒的細(xì)胞上清（空白對照）中未檢測到HBsAg和HBeAg表達(dá)，而轉(zhuǎn)導(dǎo)rAAV8-1.3HBV-C-MDR和rAAV8-1.3HBV-C-WT后Huh7細(xì)胞可有效表達(dá)HBsAg和HBeAg，且2者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.630，P=0.211；t=2.277，P=0.246）（圖2）。

圖2 Huh7細(xì)胞上清中HBsAg和HBeAg的表達(dá)Figure 2 Expression of HBsAg and HBeAg in supernatant of Huh7 cells

2.3 模型小鼠血清HBV DNA載量動態(tài)檢測結(jié)果 將重組病毒rAAV8-1.3HBV-C-MDR，rAAV8-1.3HBV-C-WT經(jīng)尾靜脈注射至C57BL/6小鼠體內(nèi)，注射后第2、3、5、7、9周HBV-C-MDR組和HBV-C-WT組小鼠血清中均能檢測到HBV DNA且病毒載量漸趨穩(wěn)定，HBV-C-MDR組和HBVC-WT組小鼠血清HBV DNA波動范圍分別為3.67 ～ 4.06 lg IU/ml和 4.36 ～ 5.11 lg IU/ml； 第9周HBV-C-MDR組小鼠血清HBV DNA水平為（3.90±0.24）lg IU/ml，HBV-C-WT組小鼠血清HBV DNA水平為（5.11±0.32）lg IU/ml。注射病毒2周后HBV-C-MDR組小鼠血清HBV DNA水平顯著低于HBV-C-WT組；組內(nèi)不同時間點(diǎn)小鼠血清HBV DNA水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[4]。見圖3。

圖3 不同時間點(diǎn)2組小鼠血清HBV DNA水平F組間=54.756，P=0.001；F時間=1.250，P=0.322Figure 3 HBV DNA load in mouse serum at different time points in both groups

2.4 模型小鼠血清抗原動態(tài)檢測結(jié)果 C57BL/6小鼠注射 rAAV8-1.3HBV 后的第 2、3、5、7、9周，使用ELISA法檢測小鼠血清（1∶20倍稀釋）中HBsAg和HBeAg的水平，結(jié)果見圖4和圖5所示。結(jié)果顯示，注射病毒2周后HBV-CMDR組和HBV-C-WT組小鼠血清中均可檢測到HBsAg和HBeAg高表達(dá)，HBV-C-MDR組HBsAg和 HBeAg OD值分別為3.501±0.230和2.989±0.250，HBV-C-WT組HBsAg和HBeAg OD值分別為 3.967±0.230和 3.384±0.230。HBV-C-MDR組HBsAg和HBeAg水平均低于HBV-C-WT組（P均＜0.05）。不同時間點(diǎn)HBsAg水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中，第2周與第3周、第3周與第5周、第5周與第7周相比，HBsAg水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）；第7周與第9周相比，HBsAg水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.011）；不同時間點(diǎn)HBeAg水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 不同時間點(diǎn)2組小鼠血清HBsAg的表達(dá)水平F組間=23.731，P=0.005；F時間=14.271，P=0.000；cutoff.臨界值Figure 4 Expression of serum HBsAg in mouse serum at different time points in both groups

圖5 不同時間點(diǎn)2組小鼠血清HBeAg的表達(dá)水平F組間=129.540，P=0.000；F時間=1.896，P=0.151；cutoff.臨界值Figure 5 Expression of serum HBeAg in mouse serum at different time points in both groups

2.5 小鼠肝組織HE染色及免疫組化染色結(jié)果 病毒注射后第9周，2組小鼠采血后處死取肝臟組織，經(jīng)過固定包埋等步驟行HE染色和免疫組化染色。HE染色結(jié)果顯示2組小鼠肝細(xì)胞未有明顯損傷及炎細(xì)胞浸潤；免疫組化染色結(jié)果顯示2組小鼠肝細(xì)胞均能表達(dá)HBsAg和HBcAg（圖6）。

3 討 論

核苷（酸）類藥物為目前最常用的抗HBV藥物，其中核苷類藥物包括拉米夫定，恩替卡韋，替比夫定，核苷酸類藥物包括阿德福韋酯和替諾福韋酯[8]。臨床上，核苷（酸）類藥物的長期序貫治療在抑制前一種藥物耐藥突變株的同時，也增加了對后一種藥物耐藥突變株的篩選，增加了MDR HBV篩選的可能[9]。本課題組前期分離鑒定了16種MDR HBV株，并在國內(nèi)外首次建立了C基因型MDR HBV穩(wěn)定復(fù)制細(xì)胞系，具備了體外細(xì)胞水平研究C基因型MDR HBV的工具。為了能夠深入研究C基因型MDR HBV的體內(nèi)病毒學(xué)特性及優(yōu)化治療方案，仍需要合適的C基因型MDR HBV動物模型。

近年來，HBV復(fù)制小鼠模型構(gòu)建有很大的研究進(jìn)展，但小鼠肝細(xì)胞缺乏HBV進(jìn)入胞內(nèi)所需的特異性受體及與HBV作用的某些蛋白，無法直接應(yīng)用感染性HBV接種的方法制備模型[10]?，F(xiàn)有的HBV小鼠模型大多是通過高壓水動力法將HBV基因組導(dǎo)入到肝臟或者直接利用轉(zhuǎn)基因方法制備，但通過轉(zhuǎn)基因方法得到的HBV復(fù)制小鼠對HBV抗原天然免疫耐受[11-12]，成模率低且小鼠血清中檢測不到HBeAg的表達(dá)[13]，而通過高壓水動力法獲得的HBV復(fù)制小鼠模型病毒持續(xù)時間短，不能獲得持續(xù)復(fù)制的HBV小鼠模型，故不適用于慢性HBV感染的研究[14-15]。有研究發(fā)現(xiàn)利用攜帶1.3拷貝HBV基因組的rAAV8介導(dǎo)的HBV復(fù)制小鼠模型能夠在小鼠肝細(xì)胞中自發(fā)回復(fù)形成染色體外環(huán)狀閉合HBV基因組DNA，對肝臟有很高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，且在小鼠血清中能夠持續(xù)檢測到HBV DNA、HBsAg和HBeAg表達(dá)[7]。

本研究在課題組前期構(gòu)建C基因型穩(wěn)定復(fù)制表達(dá)WT HBV小鼠模型的基礎(chǔ)上[16]，為了進(jìn)行MDR HBV相關(guān)研究，采用rAAV8為載體，課題組前期發(fā)現(xiàn)的患者來源的MDR HBV全基因組序列，尾靜脈注射小鼠后可在肝細(xì)胞內(nèi)表達(dá)HBV。持續(xù)觀察9周，小鼠血清中HBV DNA載量均在103IU/ml以上。與WT HBV小鼠模型相比，MDR HBV小鼠模型血清HBV載量較低，分析原因可能由于MDR HBV本身復(fù)制力比WT HBV低，這與前期體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示的MDR HBV有較低的病毒復(fù)制力結(jié)果相符[17]。注射病毒第2周，實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠血清均表達(dá)高水平HBV DNA，隨后HBV DNA水平漸趨穩(wěn)定，第2周HBV DNA不穩(wěn)定可能因?yàn)榻?jīng)尾靜脈注射病毒后，病毒短期內(nèi)未能全部到達(dá)肝臟且部分存在于血液中的病毒未能完全代謝，待造模觀察幾周后，其水平逐漸趨向穩(wěn)定。另外，在注射病毒觀察期間，實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠血清中均能檢測到HBsAg和HBeAg的表達(dá)；注射病毒后第9周，2組小鼠肝組織HBsAg和HBcAg免疫組化檢測均為陽性，直接驗(yàn)證了模型小鼠可以在肝臟中表達(dá)HBsAg和HBcAg。

總之，本研究建立了rAAV8介導(dǎo)的C基因型MDR HBV小鼠模型，血清中HBV DNA、HBsAg和HBeAg可持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)，肝細(xì)胞內(nèi)可檢測到HBV相關(guān)抗原HBsAg和HBcAg，為后續(xù)體內(nèi)動物水平評價抗MDR HBV藥物療效提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。該模型制備過程相對簡單，病毒表達(dá)持續(xù)時間長，但由于rAAV8載體介導(dǎo)的小鼠HBV復(fù)制表達(dá)模型同樣缺少HBV進(jìn)入宿主的自然感染環(huán)節(jié)，故本模型在研究MDR HBV與宿主免疫應(yīng)答等方面的應(yīng)用價值有限。

圖6 小鼠肝組織病理檢測結(jié)果HBV-C-MDR小鼠肝臟組織HE染色（A，200倍）、HBsAg免疫組織化學(xué)染色（B，400倍）和HBcAg免疫組織化學(xué)染色（C，400倍）；HBV-C-WT小鼠肝臟組織HE染色（D，200倍）、HBsAg免疫組織化學(xué)染色（E，400倍）和HBcAg免疫組織化學(xué)染色（F，400倍）。箭頭指示為染色陽性細(xì)胞Figure 6 Pathological results of liver tissue in mouse models