大熊貓RPL35A基因的克隆及超表達(dá)研究

杜玉杰，侯萬(wàn)儒

（1.湛江幼兒師范?？茖W(xué)校 科學(xué)教育系，廣東 湛江 524048；2.西華師范大學(xué) 生命科學(xué)院，四川 南充 637009）

0 引 言

核糖體的大小亞基約由80種核糖蛋白構(gòu)成，對(duì)核糖蛋白的研究一直是遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究的重要領(lǐng)域［1-2］。核糖體蛋白L35A基因（簡(jiǎn)稱RPL35A），位于3號(hào)染色體的q29-qter區(qū)段，編碼大亞基中的核糖體蛋白L35AE家族中的RPL35A蛋白。在小鼠中，該蛋白位于核糖體中的P位和A位或完全位于P位，與啟動(dòng)因子及延伸因子相結(jié)合參與核糖體的翻譯活動(dòng)［3-4］。

大熊貓（Ailuropoda melanoleuca）是極其寶貴的自然歷史遺產(chǎn)，具有重要的學(xué)術(shù)研究?jī)r(jià)值，但屬于高度瀕危物種，被列入《中國(guó)國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物名錄》Ⅰ級(jí)、《華盛頓公約》CITESⅠ級(jí)保護(hù)動(dòng)物和《世界自然保護(hù)聯(lián)盟》（IUCN）2016年瀕危物種紅色名錄ver 3.1— 易危（VU）。多年來，對(duì)大熊貓傳統(tǒng)的研究和保護(hù)工作局限于大熊貓生態(tài)、分類、飼養(yǎng)、繁育、疾病等方面［5-7］；近年來，研究重心多集中在遺傳多樣性、親子關(guān)系鑒定以及系統(tǒng)發(fā)育等遺傳學(xué)領(lǐng)域；目前，從分子水平研究、保護(hù)大熊貓的基因資源成為研究重點(diǎn)和熱點(diǎn)領(lǐng)域［8-18］，為破解大熊貓繁殖力低下難題，提高人工繁育大熊貓能力提供新的途徑。本研究以大熊貓骨骼肌為材料，克隆出核糖蛋白基因RPL35A的cDNA序列和基因組序列，對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；并對(duì)克隆序列及其編碼蛋白的特性進(jìn)行詳細(xì)的比較分析，為進(jìn)一步研究RPL35A蛋白的功能打下基礎(chǔ)，也為更深入開展大熊貓分子生物學(xué)研究和推進(jìn)針對(duì)大熊貓其他方面的科學(xué)研究積累科學(xué)的資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

大熊貓骨骼肌組織取自四川臥龍中國(guó)保護(hù)大熊貓中心死亡的大熊貓。

總RNA抽提試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、膠回收試劑盒、Taq DNA聚合酶、PUC18載體試劑盒、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ 購(gòu)自深圳市寶安康生物技術(shù)有限公司；引物由金斯瑞生物技術(shù)有限公司合成；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

宿主菌為E.coliJM109，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方 法

1.2.1 提取RNA

取適量肌肉組織迅速放于液氮中充分研磨，然后利用總RNA抽提試劑盒提取總RNA，用于后續(xù)反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)

檢索 Genbank中已報(bào)道的人（Homo sapiens）（NM_000996.2）、牛（Bos Taurus）（NM_001025321.2）、褐家鼠（Rattus norvegicus）（NM_021264.3）及小家鼠（Mus musculus）（NM_001130484.1）的 RPL35A的編碼序列作為依據(jù)，設(shè)計(jì)引物：

前引物為 5′-TATGTCTGGAAGGCTGTGGT-3′；

后引物為 5′-AGTTTAAATCCGTGAAGGGT-3′

1.2.3 cDNA克隆

采用20μL反應(yīng)體積合成cDNA第一鏈：約 1μg RNA模板，0.5μg Oiligo（d T）15引物，15 U AMV反轉(zhuǎn)錄酶，1 mM dNTPs，10 U／μL RNA酶抑制劑，5 mM MgCl2；反轉(zhuǎn)錄溫度為 42℃，時(shí)間為1h。

再采用25μL的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)：適量的cDNA第一鏈模板，所設(shè)計(jì)的前后引物各0.3μM，200μM dNTP，1.5 mM MgCl2，5 U Taq DNA聚合酶進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）；反應(yīng)條件如下：94℃，3 min；94℃，1 min；45℃，0.5 min；72℃，1.5 min，30個(gè)循環(huán)，72℃，10 min；反應(yīng)結(jié)束后，用 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

回收并純化產(chǎn)物，與酶切好的pET28a質(zhì)粒置于22℃下12 h進(jìn)行連接反應(yīng)。

常規(guī)法轉(zhuǎn)化E.coliJMl09感受態(tài)細(xì)胞，煮沸法提取質(zhì)粒，用EcoRⅠ、HindⅢ進(jìn)行雙酶切，最后PCR鑒定重組質(zhì)粒并選取重組質(zhì)粒培養(yǎng)，送出測(cè)序。

1.2.4 RPL35A基因組序列克隆

采用前述引物，應(yīng)用降落-PCR進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件如下：第1個(gè)循環(huán) 94℃ 30 s，62℃ 45 s，72℃4 min；后續(xù)反應(yīng)每經(jīng)過一次循環(huán)降低1℃，共20個(gè)循環(huán)；然后再進(jìn)行15個(gè)循環(huán)：94℃ 30 s，52℃ 45 s，72℃4 min。鑒定并送出測(cè)序。

1.2.5 RPL35A基因的誘導(dǎo)表達(dá)

本實(shí)驗(yàn)采用IPTG（isopropyl-b-D-thiogalactopyranoside）誘導(dǎo) RPL35A基因表達(dá)，分別在誘導(dǎo)培養(yǎng)0、0.5、1.5、2、2.5、3和3.5時(shí)各收集1 mL菌液，分別加入100μL含溴酚藍(lán)的蛋白提取液，100℃變性5 min；4℃，10 000 rpm／min離心5 min，取上清；取40μL上清液進(jìn)行SDS-PAGE［13］，檢測(cè)該蛋白是否與理論大小相符。

2 結(jié) 果

2.1 提取的總RNA

按RNA提取試劑盒的推薦方法提取總RNA，電泳條帶清晰明亮，表明所提RNA質(zhì)量良好，可用于反轉(zhuǎn)錄。

2.2 RPL35A基因cDNA序列及測(cè)序

將所克隆RPL35A基因的cDNA序列進(jìn)行電泳，顯示在大約300 bp處有一條明亮的條帶（圖1），符合預(yù)期長(zhǎng)度。將測(cè)序結(jié)果用Blast檢索，發(fā)現(xiàn)該序列與已報(bào)道的RPL35A基因序列的同源性很高，這表明克隆產(chǎn)物就是大熊貓RPL35A基因的cDNA序列。該序列已提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)（bankit1393572）。

2.3 RPL35A基因組序列及測(cè)序

將所克隆RPL35A基因的基因組序列進(jìn)行電泳，在大約1 200 bp處顯示有一條明亮的條帶（圖2），與預(yù)期長(zhǎng)度相符。將測(cè)序結(jié)果與cDNA序列比對(duì)，cDNA序列與該基因2-165；1104-1272兩個(gè)片段完全相符，這表明該克隆產(chǎn)物就是大熊貓RPL35A的基因組序列。該序列已提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)（bankit1393573）。

2.4 RPL35A基因的誘導(dǎo)表達(dá)

誘導(dǎo)RPL35A基因在BL21細(xì)胞系中的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示，RPL35A蛋白與組氨酸標(biāo)簽蛋白融合形成18 kDa的融合蛋白（圖3）。

圖1 大熊貓 R PL35A基因表達(dá)序列 R T- PCR結(jié)果

圖2 大 熊貓 R PL35A基 因組序列擴(kuò)增結(jié)果

圖3 大腸桿菌中表達(dá)產(chǎn)物的SDS- PAGE凝膠電泳分析圖

3 討 論

3.1 基因序列的保守性

對(duì)克隆的大熊貓RPL35A基因的cDNA序列測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)大熊貓RPL35A的cDNA序列ORF為 333 bp。將其分別與報(bào)道的人（Homo sapiens）、牛（Bos taurus）、褐家鼠（Rattus norvegicus）、小家鼠（Mus musculus）的RPL35A基因的編碼序列進(jìn)行比對(duì)可知，編碼序列同源性在90%以上（表1）。

表1 大熊貓與另外4個(gè)物種的RPL35A基因的cDNA序列、氨基酸序列及蛋白理化性質(zhì)比較

對(duì)克隆的大熊貓RPL35A基因的基因組序列測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該序列包含了2-165和1104-1272兩個(gè)外顯子，與已報(bào)道的人、牛、小家鼠及褐家鼠RPL35A基因的序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，外顯子在不同物種中的數(shù)目和分布位置都存在一定差異（表2），但外顯子片段的同源性高達(dá)90%以上。上述分析表明該基因的編碼序列高度保守，能真實(shí)地反應(yīng)物種間的進(jìn)化關(guān)系，在物種進(jìn)化研究中具有一定的參考意義和研究?jī)r(jià)值。

表2 RPL35A基因組序列中外顯子在五個(gè)物種中的比較

3.2 蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的保守性

大熊貓RPL35A蛋白由110個(gè)氨基酸，利用Proteomics Server軟件對(duì)其分析發(fā)現(xiàn)：該蛋白質(zhì)序列中包含27個(gè)帶正電荷的氨基酸殘基（精氨酸、賴氨酸和組氨酸），5個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸殘基（谷氨酸和天冬氨酸），其余氨基酸均為中性。將其分別與人（Homo sapiens）、牛（Bos taurus）、小家鼠（Mus musculus）及褐家鼠（Rattus norvegicus）的RPL35A的氨基酸序列比對(duì)可知，RPL35A基因編碼的氨基酸序列在不同的物種中同源性很高，可達(dá)99%以上（表1）。

3.3 RPL35A蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)

利用APSSP2軟件分析RPL35A蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)顯示，27.27% 的氨基酸序列以伸展片帶形式存在，40.00%的氨基酸序列以α螺旋形式存在，32.73%的氨基酸序列以折疊無(wú)規(guī)卷曲形式存在（表3）。進(jìn)一步比較分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)的存在形式及其所占比例在5個(gè)物種間差異非常小。

表3 RPL35A蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)比較（%）

3.4 蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的功能位點(diǎn)

利用Proteomics Server軟件對(duì)大熊貓RPL35A蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)：該蛋白含有5種類型共7個(gè)功能位點(diǎn)：即2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)、1個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、1個(gè)酰胺化位點(diǎn)、2個(gè)N-酰基化位點(diǎn)及1個(gè)C末端靶向信號(hào)位點(diǎn)。進(jìn)一步比較分析發(fā)現(xiàn)，大熊貓與另外四個(gè)物種的該蛋白質(zhì)功能位點(diǎn)的數(shù)量、類型及分布位置均一致（圖4）。

圖4 RPL35A 氨基酸序列中功能位點(diǎn)在不同物種的比較

進(jìn)一步分析圖5可知，上述物種中該蛋白序列在各功能位點(diǎn)內(nèi)部無(wú)任何氨基酸序列的變異，這表明該蛋白質(zhì)的功能極其保守；而僅僅在功能位點(diǎn)外的第7位氨基酸的構(gòu)成上有差異，從功能位點(diǎn)的種類和分布來看，該差異并沒有對(duì)該蛋白的主要功能造成影響，但是否會(huì)對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)等產(chǎn)生影響還有待進(jìn)一步研究。

對(duì)該蛋白質(zhì)的分子量及等電點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)分子量為12.5355kDa，pI為11.63，且各物種中該蛋白的分子量和等電點(diǎn)都十分接近（表3）。

Feo S和Colombo P的研究表明，RPL35A蛋白是核糖體小亞基中的P位和大亞基的A位組成部分，在蛋白質(zhì)翻譯過程中可與啟動(dòng)因子及延伸因子相結(jié)合，對(duì)于核糖體執(zhí)行蛋白質(zhì)工廠的功能至關(guān)重要［3-4］。本研究一系列討論結(jié)果表明RPL35A蛋白的理化性質(zhì)和功能位點(diǎn)在哺乳動(dòng)物中高度保守，由此可推測(cè)該蛋白在大熊貓中的具體功用很可能與其他哺乳動(dòng)物類似。

3.5 RPL35A基因的超表達(dá)

RPL35A基因的超表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，分析電泳圖譜發(fā)現(xiàn)，該基因在經(jīng)IPTG誘導(dǎo)0.5 h后開始表達(dá)，2 h后達(dá)到了最高表達(dá)水平，這表明RPL35A基因在BL21細(xì)胞系中可以表達(dá)，且表達(dá)出的蛋白質(zhì)具有活性；表達(dá)產(chǎn)物將提純并進(jìn)一步用于該蛋白質(zhì)的功能研究，以明確該蛋白在大熊貓核糖體中的具體功用。

由上述討論可知RPL35A基因及其編碼的蛋白序列高度保守，這一結(jié)論表明該基因及其編碼蛋白能真實(shí)地反應(yīng)物種間的進(jìn)化關(guān)系，可用于分子進(jìn)化方面的研究，在物種進(jìn)化關(guān)系的研究中具有一定的參考意義和研究?jī)r(jià)值；同時(shí)，該基因可在原核生物中表達(dá)出具有活性的產(chǎn)物，這表明可在該基因克隆和表達(dá)研究工作的基礎(chǔ)上進(jìn)一步開展蛋白質(zhì)功能的研究，以明確該蛋白在大熊貓核糖體中的具體功用，從而為從基因水平保護(hù)大熊貓?zhí)峁┛茖W(xué)依據(jù)。