高原地區(qū)藏族人群慢性鼻竇炎炎癥模式與微生物定植相關(guān)性研究*

邊片 巴羅 次仁德吉 米瑪 楊芳麗 巴頓

(1.西藏日喀則市人民醫(yī)院綜合內(nèi)科,西藏 日喀則 857000；2.西藏自治區(qū)人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，西藏 拉薩 850000)

慢性鼻竇炎嚴(yán)重影響人類健康生活，其發(fā)病率呈不斷增長趨勢，在西方國家發(fā)病率高達(dá)20%以上[1]。我國各地方慢性鼻竇炎的患病率和發(fā)病率都較高并有逐年增加趨勢，但目前尚無權(quán)威性流行病學(xué)統(tǒng)計數(shù)據(jù)。目前慢性鼻竇炎伴息肉(CRSwNP)研究較為廣泛且存在區(qū)域及種族間顯著差異；最典型特征免疫效應(yīng)性T細(xì)胞上目前慢性鼻竇炎中已知的有Th1/Th2/Th17等細(xì)胞，在歐美人群中慢性鼻竇炎中慢性鼻竇炎不伴息肉 (CRSsNP)中以Th1/Th17占優(yōu)勢，而CRSwNP中以表現(xiàn)Th2占優(yōu)勢并且與哮喘發(fā)病存在顯著相關(guān)[2-3]。相反在相似臨床特征的亞洲人種鼻息肉中相對缺乏嗜酸性粒細(xì)胞浸潤及相關(guān)因子的表達(dá)，主要以中性粒細(xì)胞浸潤并相關(guān)因子表達(dá)為主，并且以Th1/Th17極化特征；其哮喘發(fā)病率較低且與金葡菌超抗原無顯著相關(guān)性[4-5]。近年來國內(nèi)不同地區(qū)慢性鼻竇炎研究發(fā)現(xiàn)其免疫表型及機(jī)制尚存在較大差異，表明慢性鼻竇炎異質(zhì)性很強(qiáng)[6-8]。西藏高原地區(qū)門診病人中慢性鼻竇炎居耳鼻咽喉科疾病譜首位，藏族人群大部分居住于平均海拔4000米以上的寒冷空氣稀薄地帶、日照長濕度低等環(huán)境相對惡劣，加之醫(yī)療條件相對較落后及診療觀念較為傳統(tǒng)[9]。造成人群中慢性鼻竇炎從病因、發(fā)病機(jī)制特點上與其它地方可能存在較大地域差異，為此我們對該人群中CRS進(jìn)行深入研究，以有助于發(fā)現(xiàn)更有效的治療靶點。

1 對象和方法

1.1 對象選擇 分別收集2016年3月～2017年10月在日喀則市人民醫(yī)院和西藏自治區(qū)人民醫(yī)院耳鼻喉科就診的105例患者(女性46名，男性59名)，年齡16～60歲；其中慢性鼻竇炎35例(CRSsNP 35例)，慢性鼻竇性伴鼻息肉40例(CRSwNP 40例)，鼻中隔偏曲30例(對照組)。術(shù)前所有患者停用各種劑型類固醇激素和抗生素至少3周以上。排除和納入標(biāo)準(zhǔn)按EP3OS指南[1]。標(biāo)本收集；CRSwNP患者樣本取自息肉組織，CRSsNP患者鉤突及篩竇黏膜，對照組織樣本取自中隔偏曲行鼻中隔成型術(shù)患者的部分中鼻甲粘膜組織。將組織樣本于術(shù)中采集后迅速置于液氮中冷凍并轉(zhuǎn)送實驗中心儲存于-80°C 冰箱標(biāo)本庫免疫檢測備用，另將較小塊用于免疫組化分析的組織于4%福爾馬林固定并繼石蠟包裹。對所有篩選進(jìn)入研究的受試者均術(shù)前對癥狀進(jìn)行VAS分級評分及咽式子鼻腔分泌物送微生物細(xì)菌培養(yǎng)等。

1.2 研究方法

1.2.1 免疫熒光檢測炎癥因子 將105例標(biāo)本先行稱重，每0.1g 標(biāo)本加入1.0ml 0.9%NaCl溶液，勻漿前加入混合蛋白酶抑制劑(Complete Roche; Mannheim, Germany)。組織勻漿(Braun 勻漿器1500rpm轉(zhuǎn)速5分鐘)。勻漿液在4°C下離心(3000rpm轉(zhuǎn)速，15分鐘),收集上清液分裝EP管-80°保存待免疫物質(zhì)檢測分析。采用Luminex 100分析儀(Luminex 100 System, Ausin, Tesas USA)，試劑盒為Fluorokine MAP Multiplex Kits (R&D Systems, Minneapolis,MN,USA)，測定 IL-1β、IL-2sRα、IL-5、IL-6、IL-8、IL-17和 IFN-γ等, 使用Unicap100分析儀檢測ECP、MPO 和總IgE水平，操作步驟嚴(yán)格依從試劑盒說明。

1.2.2 免疫組化 主要用于評估B細(xì)胞(CD20)、單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)(CD68)、漿細(xì)胞(CD138)、肥大細(xì)胞(肥大細(xì)胞類胰蛋白酶)、T細(xì)胞(CD4)及中性粒細(xì)胞(MPO)等。石蠟切片37℃風(fēng)干24小時，常規(guī)脫蠟至水；蒸餾水洗3次；進(jìn)一步分別與1%濃度的鼠坑人單克隆抗體；CD20 (clone L26; Dako)、CD68 (clone EBM11;Dako)、CD138 (clone MI15; Dako)、MPO (clone 2C7; Serotec, Oxford, UK)、肥大細(xì)胞類胰蛋白酶(clone AA1;Dako)以及1%人抗CD4抗體(AF-379-NA, R&D)在30°C下培養(yǎng)45分鐘后用三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水沖洗10分鐘，并且進(jìn)一步與EnVision (DaKo Cytomation, California, USA)。再次在30°C下培養(yǎng)45分鐘，所有操作使用免疫組化全自動染色機(jī)(Autostainer，DaKo,USA)完成，最終蘇木精復(fù)染。染色后的切片被酸化水用兩步法沖洗，然后用100%的乙醇通過三步法脫水并且用Permount TM 爬片設(shè)備(Bioss, Beijing, China)爬片，中性樹膠封固。

1.2.3 微生物鑒定 術(shù)前無菌操作下利用咽式子于雙側(cè)鼻腔中鼻道取出分泌物送微生物細(xì)菌培養(yǎng)，按照嚴(yán)格無菌原則將分泌物分別在羊血瓊脂 (DiMed, St.Paul,Minn USA), 伊紅美藍(lán)瓊脂(Baltimore Biological Laboratories, Cockeysville,Md. USA) 和巧克力瓊脂(BioMerieux, Marcy l'Etoile, France)等培養(yǎng)基上培養(yǎng)。所有培養(yǎng)基根據(jù)菌種需要在25-37℃室溫及有氧或無氧條件下培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)菌學(xué)方法分別在24小時，48小時及72小時不同時間段上觀察細(xì)菌生長情況，若超過72小時無細(xì)菌生長視為無培養(yǎng)菌。培養(yǎng)滿3天后通過濁度分析法將明確生長或懷疑生長的菌落分別置于3種不同Vitek系統(tǒng)細(xì)菌菌譜鑒定卡(bioMérieux, 中國上海)，主要由；GP卡辨認(rèn)所有革蘭氏陽性球菌，GN卡辨認(rèn)所有革蘭氏陰性桿菌和YST卡辨認(rèn)芽孢真菌類等，按照使用說明培養(yǎng)鑒定[7]。光學(xué)掃描器根據(jù)測量光線強(qiáng)弱來決定細(xì)菌菌種。數(shù)據(jù)資料將ID 32E 系統(tǒng)分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)資料應(yīng)用統(tǒng)計分析軟件包SPSS18.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。定量資料采用非參數(shù)檢驗(秩和檢驗Kruskal-Wallis和Mann-Whitney 雙尾U檢驗)，檢驗水準(zhǔn)α=0.05；基線變化分析采用方差分析或Fisher確切概率法及卡方檢驗等。

2 結(jié)果

2.1 三組一般資料及臨床特點比較 根據(jù)EPOS指南對納入的各組進(jìn)行臨床癥狀評分，兩組鼻竇炎與對照組相比有較顯著差異。主要表現(xiàn)在；總癥狀評分明顯偏高，以鼻阻，流涕，頭疼及失嗅為主要癥狀。其中鼻息肉中以鼻阻、失嗅、鼻癢癥狀和哮喘發(fā)病率有顯著升高，而單純鼻竇炎中以頭痛及流涕較為明顯。影像學(xué)上鼻息肉積分最高鼻竇炎為其次各組間有統(tǒng)計學(xué)差異。見表1。

表1 三組一般資料及臨床癥狀比較 Table 1 Patient characteristics and symptom scores

2.2 藏族人群不同臨床表型慢性鼻竇炎中免疫細(xì)胞因子指標(biāo)比較 CRSsNP中IFN-γ、IL-17及L-8, IL-2sRa、IL-1β及MPO表達(dá)水平顯著高于對照組(P<0.05),其中部分指標(biāo)比CRSwNP中呈增高趨勢。CRSwNP患者息肉組織中IL-5、ECP、IL-6及總IgE水平顯著高于CRSsNP和對照組。見表2。

2.3 CRS中各種炎癥細(xì)胞計數(shù)比較 各標(biāo)記物免疫組化在兩組鼻竇炎均有不同程度的表達(dá)，其中CD4、CD20及CD138細(xì)胞計數(shù)兩組鼻竇炎中的表達(dá)均高于對照組(P<0.05)，而兩組鼻竇炎間無顯著差異。Trytase(肥大細(xì)胞)和HE(嗜酸性細(xì)胞)細(xì)胞計數(shù)在鼻息肉組中顯著高于其他兩組(P<0.05)；而MPO及CD68表達(dá)陽性細(xì)胞計數(shù)在單純鼻竇炎中顯著高于其他組(P<0.05)，見表3。

表2 三組中主要炎癥介質(zhì)表達(dá)差異的比較Table 2 The concentrations of inflammatory mediators

注：數(shù)據(jù)由中位數(shù)和可信區(qū)間表達(dá)，P值由非參數(shù)U檢驗。P≤0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義 ( NS;沒有顯著性差異. ;對照vs 鼻竇炎.;對照vs 鼻息肉. §;鼻竇炎 vs 鼻息肉)

表3 免疫組化表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)比較Table 3 IHC staining positive cells count

注：標(biāo)記物代表細(xì)胞：CD4(T細(xì)胞)， CD20(淋巴細(xì)胞)， CD138(漿細(xì)胞)，Trytase(肥大細(xì)胞)，MPO(中性粒細(xì)胞)，CD68 (單核巨噬細(xì)胞)，HE(嗜酸性粒細(xì)胞)。標(biāo)注：NS;無顯著差異 ;對照vs鼻竇炎;對照vs 鼻息肉. §;鼻竇炎 vs 鼻息肉

2.4 不同鼻竇炎及對照中鼻腔微生物培養(yǎng)結(jié)果 在伴有鼻息肉鼻竇炎中革蘭氏陽性菌培養(yǎng)率增高且與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P≤0.05)，其中金黃色葡萄球菌與其它組有明顯差異(均P≤0.05);反之在不伴有息肉鼻竇炎中革蘭氏陽性菌培養(yǎng)較為明顯但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表4。

表4 不同鼻竇炎及對照中鼻腔微生物分類比較[n(×10-2)]Table 4 Microbial species isolated from the nasal passages of control and CRS

3 討論

目前由于對慢性鼻竇炎炎癥免疫機(jī)制的復(fù)雜性及調(diào)控因素全面深入認(rèn)識的缺乏，造成不同種族、區(qū)域表現(xiàn)不同免疫表型及炎癥模式特征的報道[10-11]。為此，根據(jù)現(xiàn)在尚存免疫表型機(jī)制多樣性特點將CRS表型進(jìn)行深入廣泛研究勢在必行[12]，只有表型機(jī)制的深入研究可能解決慢性鼻竇炎治療上比較單一干預(yù)手段及突破開展基礎(chǔ)研究的瓶頸[13]。盡管絕大多數(shù)白種人群慢性鼻竇炎中CRSwNP顯示Th2免疫表型嗜酸性炎癥模式特征[2,5]；亞洲人群CRSwNP中主要以Th1或Th17傾向中性粒細(xì)胞炎癥特征，并且哮喘發(fā)病率明顯低于西方人群[4，6-7]。但不論種族、區(qū)域不同大部分其CRSsNP均表現(xiàn)為Th1免疫表型中性粒細(xì)胞炎癥趨勢之特征。高原藏族人群大部分常年居住高寒空氣稀薄惡劣環(huán)境地帶，加之醫(yī)療條件較落后及診療觀念較為傳統(tǒng)。由于地域限制造成的潛在隔離性決定了慢性鼻竇炎病因?qū)W上與其它地域可能存在較大差異， 由此可能導(dǎo)致免疫機(jī)制上存在特殊的一面[9]。為此我們開展藏族人群慢性鼻竇炎臨床特征及基礎(chǔ)免疫微生物研究發(fā)現(xiàn)；其中CRSwNP比CRSsNP具有更強(qiáng)炎癥浸潤現(xiàn)象，進(jìn)一步免疫指標(biāo)檢測提示CRSwNP中Th2相關(guān)因子IL-5、ECP和IgE升高，同時還伴隨IL-6顯著升高。組織學(xué)上以浸潤嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞更為顯著；而在 CRSsNP中具有Th1相關(guān)因子IFN-γ與Th17相關(guān)IL-17升高趨勢，組織學(xué)有較強(qiáng)MPO+(中性粒細(xì)胞)和CD68+ (巨噬細(xì)胞)浸潤表達(dá)。同樣兩組CRS中均有較強(qiáng)CD4+(T淋巴細(xì)胞), CD138+(漿細(xì)胞)和CD20+(B淋巴細(xì)胞)等各種炎癥細(xì)胞浸潤表達(dá)，表明二者均有較強(qiáng)炎性反應(yīng)特征。從兩組鼻竇炎免疫炎癥特征能夠初步反應(yīng)其炎癥趨勢性特征，即反映伴有息肉的鼻竇炎多類似于變態(tài)反應(yīng)改變?yōu)檎純?yōu)勢；而不伴鼻息肉鼻竇炎表現(xiàn)出鼻鼻竇黏膜局部細(xì)菌感染導(dǎo)致。另外CD68+特異性巨噬細(xì)胞浸潤與TGF-b1增高組織重塑更能說明單純鼻竇炎中細(xì)菌感染所發(fā)生的免疫連鎖反應(yīng)，也符合國內(nèi)外眾多文獻(xiàn)報道[14-15]。另外，上述結(jié)果中CRSsNP免疫炎癥特征與眾多亞洲及西方人群CRS免疫炎癥趨勢相符合[16]，而CRSwNP免疫反應(yīng)呈現(xiàn)出Th2傾向嗜酸性炎癥反應(yīng)特征類似白種人免疫反應(yīng)趨勢，偏離亞洲人群鼻息肉免疫表性特征。而在泰國人群鼻息肉中同樣Th17傾向中性粒細(xì)胞炎癥模式型居多，但發(fā)現(xiàn)隨著時間的推移其向Th2傾向嗜酸性炎癥模式的轉(zhuǎn)化趨勢[17]，而我們的結(jié)果首先不排除樣本偏小及實驗誤差所致的偏差，再者理論上也存在該趨勢的可能，因此有待于更深入驗證研究。

基于上述結(jié)論我們進(jìn)一步結(jié)合術(shù)前進(jìn)行微生物培養(yǎng)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)藏族CRSwNP中更多G+細(xì)菌生長，相對在CRSsNP中G-細(xì)菌較為顯著，預(yù)示著最近文獻(xiàn)報道不同的微生物組可能與某些類型的免疫反應(yīng)相關(guān)[18]。我們初步推斷可疑高原特殊環(huán)境對鼻腔微生物譜系有影響并與平原地區(qū)有所不同，由此高原地區(qū)慢性鼻竇炎免疫炎癥模式有其獨特一面值得深入研究。至于導(dǎo)致CRSwNP免疫表型上存在太大差異，本研究中出現(xiàn)與亞洲人群不同分歧性結(jié)果，可能歸因于高原特殊環(huán)境下慢性鼻竇炎鼻腔微生物定植存在某種缺氧性微環(huán)境下致病菌群結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致鼻黏膜炎癥模式的改變。該結(jié)論也許可能根本從高原特殊環(huán)境或遺傳基因等各方面所導(dǎo)致值得深入研究，現(xiàn)有種種證據(jù)表明可能因不同致病菌感染或相對惡劣環(huán)境及抗生素使用不規(guī)范等眾多綜合因素結(jié)果所致[19-20]。 總之，慢性鼻竇炎免疫表型及炎癥模式在全球范圍，不論地域、種族都表現(xiàn)類似特點。而在慢性鼻竇炎伴鼻息肉中根據(jù)種族、地域，甚至相同地域不同群體中其免疫及炎癥機(jī)制略有差異。通過本研究可能歸功于外來微生物影響當(dāng)?shù)谻RS中的免疫表型，或許因遺傳、環(huán)境等因素導(dǎo)致其CRS中特有免疫表現(xiàn)形式。故有待于進(jìn)一步從免疫分子機(jī)制遺傳表觀學(xué)等方面值得更深入細(xì)致研究。

4 結(jié)論與啟示

本研究不僅揭示了高原地區(qū)藏族人群慢性鼻鼻竇炎免疫表型特點，其中慢性鼻竇炎伴有鼻息肉具有Th2傾向嗜酸性炎癥模式特征并與革蘭氏陽性菌定植相關(guān)，呈現(xiàn)出類似白種人免疫反應(yīng)趨勢，偏離亞洲人群鼻息肉免疫表性特征。反之，慢性鼻竇炎不伴鼻息肉中以Th1或Th17優(yōu)勢中性粒細(xì)胞炎癥趨勢特征；并且與革蘭氏陰性菌存在某種相關(guān)性。藏族人群中出現(xiàn)與不同亞洲人群鼻息肉中表現(xiàn)Th2傾向免疫炎癥反應(yīng)特征，可能因高原特殊環(huán)境導(dǎo)致鼻腔微生物譜系的特殊改變，值得深入研究。