微生物法測定大米中葉酸含量的研究

◎ 趙 平，郭瑩瑩，楊 光，王哲明，丁松喬

（1.黑龍江省質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院，黑龍江 哈爾濱 150028；2.國家農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化監(jiān)測與研究中心（黑龍江），黑龍江 哈爾濱 150028）

葉酸是一種水溶性維生素，為維生素B復(fù)合體之一，又叫維生素B9，人類如果缺乏葉酸，會(huì)引起巨幼紅細(xì)胞貧血與白細(xì)胞減少癥。天然葉酸廣泛存在于動(dòng)植物類食品中，尤以肝及綠葉蔬菜中含量比較多[1-2]。

大米是人們生活中的主食之一，其富含豐富的B族維生素，可為人體提供所需的維生素。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用微生物法來測定分析大米中原生葉酸的含量，以鼠李糖乳桿菌為測試菌種，葉酸是其生長必需的營養(yǎng)素，利用其對(duì)葉酸的特異性，通過其生長測定大米中原生葉酸的含量，建立大米中原生葉酸含量測定的方法[3-5]。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試樣

大米，產(chǎn)地為黑龍江。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與實(shí)驗(yàn)菌種

葉酸標(biāo)準(zhǔn)品（≥99%），磷酸氫二鈉，抗壞血酸，鹽酸，氫氧化鈉，木瓜蛋白酶，α-淀粉酶，雞胰腺，0.85%氯化鈉溶液，葉酸測定用培養(yǎng)基，乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基，鼠李糖乳桿菌Lactobacillus casei spp.rhamnosus（ATCC 7469）。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備與儀器

天平（感量0.1 mg），恒溫震蕩培養(yǎng)箱，離心機(jī)，電熱鼓風(fēng)干燥箱，生化培養(yǎng)箱，液體分裝泵，pH計(jì)，潔凈臺(tái)，分光光度計(jì)，微量移液器，高壓蒸汽滅菌釜，渦旋振蕩儀。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 玻璃器皿的準(zhǔn)備

將玻璃儀器清洗干凈，然后烘干備用。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)菌種的制備

將鼠李糖乳桿菌Lactobacillus casei spp.rhamnosus（ATCC 7469）甘油管（實(shí)驗(yàn)室保存）無菌操作轉(zhuǎn)接至乳酸桿菌肉湯中，37 ℃搖床培養(yǎng)24 h，備用。

塔巴林，藏語意為“解脫園”，修建于清乾隆三十六年（1771年），相傳是噶丹東竹林寺第三世扎唐活佛倡建。當(dāng)時(shí)，在距寺院約有五里的林地中，有一處尼姑庵，只有幾名尼姑住在簡易木棚中修習(xí)。另外在奔子欄鎮(zhèn)支央村有一處小的尼姑庵，也只有幾名尼姑，僧舍也極其落魄。鑒于迪慶境內(nèi)沒有一座像樣的尼姑寺，三世扎唐活佛決定合并兩處小的尼姑庵，用內(nèi)地買來的布匹換下現(xiàn)今的寺址（寺址原來是東竹林寺所在地），并命名為“塔巴林”，為廣大女性信徒提供了一處修行地。

1.4.3 試樣的制備與提取

準(zhǔn)確稱取大米試樣（經(jīng)粉碎，過篩）10 g，至150 mL錐形瓶中。加入20 mL磷酸鹽緩沖液Ⅱ（14.2 g磷酸氫二鈉，用1 000 mL水溶解。臨用前按1.0 g/100 mL加入抗壞血酸，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7.7～7.9），混勻后加50 mL水和1.0 mL甲苯。加蓋后121 ℃滅菌15 min，然后迅速冷卻。加1mL木瓜蛋白酶溶液，于（36±1）℃保溫3 h后100 ℃加熱3 min，冷卻。加1 mL α-淀粉酶溶液，（36±1）℃保溫2 h后加4 mL雞胰腺，加蓋，（36±1）℃保溫16 h后100 ℃加熱3 min，冷卻。用1 mol/L鹽酸調(diào)pH至4.5，用水稀釋定容到100 mL。過濾得到澄清濾液，然后吸取1 mL澄清濾液用磷酸鹽緩沖液Ⅲ（14.2 g磷酸氫二鈉，用1 000 mL水溶解。臨用前按1.0 g/100 mL加入抗壞血酸，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH至6.7～6.9）定容至100 mL。同時(shí)做空白對(duì)照。

1.4.4 葉酸標(biāo)準(zhǔn)曲線管制備

取試管分別加入實(shí)驗(yàn)用水（GB/T 6682-2008規(guī)定的二 級(jí) 水）5.0、5.0、4.0、3.0、2.0、1.0、0.0、2.0、1.0、0.0 mL，每支試管中加入5.0 mL葉酸測定用培養(yǎng)基，再按相應(yīng)順序加入葉酸標(biāo)準(zhǔn)工作液（0.05 ng·mL-1）0.0、0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 和標(biāo)準(zhǔn)工作液（0.1 ng·mL-1）3.0、4.0、5.0 mL，相當(dāng)葉酸含量為0.00、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.40 ng和0.50 ng，每個(gè)梯度做3支平行管，試管加塞，121 ℃滅菌5 min。

1.4.5 試樣系列管的制備

取4支試管，分別加入4.0、3.0、2.0、1.0 mL水，試樣提取液，1.0、2.0、3.0、4.0 mL，然后加入5.0 mL葉酸測定用培養(yǎng)基。每個(gè)梯度做3支平行管。試管加塞，121 ℃滅菌 5 min。

1.4.6 接種液的制備

菌種活化好后，將菌懸液無菌條件下離心棄去上清，用無菌生理鹽水離心洗滌菌體，棄上清，反復(fù)2～3次。以生理鹽水做對(duì)照，用分光光度計(jì)測試菌液透光率，將菌液透光率調(diào)至為73%，備用。

試管滅菌后，冷卻，每支試管以無菌操作方式接入調(diào)好的菌液50 μL，標(biāo)準(zhǔn)曲線管中未接種葉酸標(biāo)樣的S1空白管除外。置37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h。

1.4.8 葉酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定與繪制

目測檢查試管，S1未接種菌液管應(yīng)是澄清的，如有混濁出現(xiàn)，則無效。用渦旋振蕩器混合每一支試管中培養(yǎng)液后，將培養(yǎng)液移入比色皿中波長550 nm處測定吸光度。以吸光度OD值為橫坐標(biāo)，葉酸標(biāo)準(zhǔn)品的含量（ng）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

以S2接種空白管為空白調(diào)零，測試每支試管的OD值。

通過葉酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，用OD值來計(jì)算每毫升培養(yǎng)液中葉酸的含量，并計(jì)算該編號(hào)的葉酸含量的平均值。用該平均值計(jì)算得出全部編號(hào)的總平均值為Cx。

葉酸含量

式（1）中：X為葉酸含量，μg/100g；Cx為總平均值，ng；m為質(zhì)量，g；f為稀釋倍數(shù)；EB為雞胰腺空白管中葉酸含量，ng/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

培養(yǎng)20 h后，OD值在葉酸含量為0～0.5 ng范圍內(nèi)的線性良好，以吸光度為橫坐標(biāo)（x）、葉酸含量為縱坐標(biāo)（y）繪制葉酸標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1.3024x2+0.4676x，r=0.996 6，如圖1所示。

圖1 吸光度與葉酸含量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 重復(fù)性試驗(yàn)

同一批次大米樣，精密稱取10次，依照此方法測定葉酸的含量，結(jié)果表明方法的重現(xiàn)性良好，見表1。由表1可得，10次檢測的平均值為12.4 μg/100 g，RSD為0.03%。

表1 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表

2.3 回收率試驗(yàn)

精密稱取同一批次大米樣品6份，2份樣品做平行實(shí)驗(yàn)測出大米的本底葉酸含量，其余4份樣品進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，測定葉酸含量并計(jì)算葉酸加標(biāo)回收率，結(jié)果計(jì)算得出回收率分別為98.9%、98.4%、97.8%、95.3%，平均回收率為97.6%，RSD為0.016%。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過利用微生物法對(duì)大米中原生葉酸含量的測定分析，測得大米樣品中原生葉酸含量的RSD為0.03%（n=10），平均回收率達(dá)97.6%。表明微生物法測定大米中原生葉酸含量的方法重現(xiàn)性好、精密度高、可靠性強(qiáng)、靈敏度高、樣品的制備與葉酸提取操作簡單，適用于大米中原生葉酸含量的測定。