高效液相色譜法同時測定甜油中苯甲酸、山梨酸、安賽蜜、糖精鈉與脫氫乙酸

◎ 戚 繁，王少偉，顏春榮，徐春祥

（江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院，江蘇 南京 210000）

甜油是江蘇省宿遷地區(qū)獨有的調(diào)味品，是一種類似醬油卻和醬油完全不同的佐料，能使菜肴變得特別鮮美。甜油既是涼拌菜的主要調(diào)料，也是燒制菜的配料，甜油的制作工藝既要求原汁原味，又要求保持各種營養(yǎng)成分；既要求無菌，又要求保留營養(yǎng)成分[1]。在含鹽量較低、水分活性較高、氣溫適宜的條件下，微生物極易繁殖而霉變，為了防止產(chǎn)品變質(zhì)，除了加熱滅菌之外，還需添加相關(guān)的防腐劑，同時一些廠家為了改良甜油的口味，會加入相應(yīng)的甜味劑。目前在我國食品行業(yè)內(nèi)，山梨酸、苯甲酸、安賽蜜、糖精鈉、脫氫乙酸已廣泛應(yīng)用于調(diào)味品、乳及乳制品、碳酸飲料、果酒和葡萄酒。一定劑量范圍內(nèi)的食品添加劑對人體是無害的，既不會影響食品的營養(yǎng)價值，同時又具有防止食品腐敗變質(zhì)、增強食品感官性狀或提高食品質(zhì)量的作用[2]。但過量的食品添加劑對人體具有一定的毒性作用，容易損害人體的健康，因此衛(wèi)生部在《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中對其應(yīng)用范圍和使用限量都有明確的規(guī)定[3]。

國家對上述食品添加劑的檢測現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)有GB 5009.28-2016《食品中苯甲酸/山梨酸和糖精鈉的測定》[4]，GB/T 5009.140-2003《飲料中乙酰磺胺酸鉀（安賽蜜）的測定》[5]，GB 5009.121-2006《食品中脫氫乙酸的測定》[6]。調(diào)味品中的食品添加劑常常是多項目的同時添加，分別對這幾種添加劑進(jìn)行檢測，不但增加工作量，延長檢測時間，也降低了檢測效率。本研究結(jié)合實際工作需要, 采用高效液相色譜法同時分離測定甜油中3種防腐劑、2種甜味劑。

甜油作為釀造調(diào)味品，其制作工藝類似醬油，含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸和糖類、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，根據(jù)GB 5009.28-2016的要求，醬油中苯甲酸、山梨酸糖精鈉的檢測前處理方法為加入亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液以沉淀蛋白，離心取上清[4]。安賽蜜、脫氫乙酸鈉的均在水中易溶，因此可以采用相同的前處理方式。本研究針對甜油樣品采用蛋白沉淀劑的前處理方式，以甲醇-乙酸銨作為流動相、紫外可變波長檢測，對上述5種添加劑同時分析測定。方法快速準(zhǔn)確，檢出限能夠達(dá)到國家單項標(biāo)準(zhǔn)要求。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

（1）儀器。Thermos高效液相色譜儀和二極管陣列檢測器（DAD），梅特勒電子天平，MILLI Q型超純水儀。

（2）試劑。甲醇（HPLC，TEDIA），乙酸鈉（AR，國藥集團化學(xué)試劑有限公司），0.02 mol·L-1乙酸銨溶液，亞鐵氰化鉀溶液，乙酸鋅溶液，苯甲酸鈉、山梨酸鉀、糖精鈉、安賽蜜、脫氫乙酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精密稱取各標(biāo)準(zhǔn)品適量于10 mL容量瓶中，用水配制1 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)混合儲備溶液。再用水稀釋成0.001、0.010、0.020、0.100 mg·mL-1和 0.200 mg·mL-1系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，濃度由低到高進(jìn)樣，以待測物質(zhì)峰面積-濃度作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。

1.3 樣品處理

稱取10 g樣品，于50 mL容量瓶中，加入2 mL亞鐵氰化鉀溶液，搖勻，再加入2 mL乙酸鋅溶液，搖勻，以沉淀蛋白，加水定容至刻度，離心，取上清，經(jīng)微孔濾膜過濾，濾液待上機分析。

1.4 色譜條件

C18色譜柱（symmetry shield RP18， 5μm，4.6×250 mm）；流動相為0.4%乙酸與0.02 mol·L-1乙酸鈉∶甲醇=75∶25；流速1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量5 μL；柱溫30 ℃；檢測波長230 nm、214 nm、293 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

2.1.1 波長的選擇

取上述各標(biāo)準(zhǔn)品溶液于200～400 nm波長處進(jìn)行掃描，繪制紫外-可見吸收光譜圖，各組分的最大吸收波長見表1?，F(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)中，苯甲酸、山梨酸、糖精鈉檢測波長為230 nm，安賽蜜為214 nm，脫氫乙酸為293 nm。本方法中使用的檢測器為DAD檢測器，因此可以提取3種波長下的色譜圖，同時實現(xiàn)5種物質(zhì)的定性及定量計算。

表1 各組分紫外最大吸收波長表

2.1.2 流動相及洗脫條件的選擇

現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、安賽蜜的檢測使用的流動相體系為甲醇-0.02 mol·L-1乙酸銨（6∶94）等度洗脫，脫氫乙酸檢測使用的流動相體系為甲醇-0.02 mol·L-1乙酸銨溶液（10∶90）。檢驗中發(fā)現(xiàn)，采用國家標(biāo)準(zhǔn)方法同時檢驗安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉時，分離度和理論塔板數(shù)均符合要求，分離所需時間為20 min，出峰順序為安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉。采用國家標(biāo)準(zhǔn)方法檢測脫氫乙酸時，會出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，理論塔板數(shù)低，影響定量分析。要同時測定上述5種添加劑，實驗室對流動相比例及pH進(jìn)行優(yōu)化，采用甲醇-0.02 mol·L-1乙酸鈉與0.4%乙酸（25∶75）等度洗脫，各主峰保留時間適宜，峰形較好，主峰與前面未知雜質(zhì)分離度為大于3.5，達(dá)到基線分離，各主峰的分離度符合要求，且脫氫乙酸的峰形得到有效改善。標(biāo)準(zhǔn)溶液典型色譜圖如圖1所示。

圖1 苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、安賽蜜與脫氫乙酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

2.1.3 柱溫的選擇

現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)中，上述5種添加劑的檢測所采用的柱溫均為30 ℃，實驗室同樣采用30 ℃對混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分離測定。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及檢出限

將1.2中的系列濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液以1.4色譜條件上機測定，以待測物質(zhì)峰面積-濃度作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。5種食品添加劑在0.001～0.200 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好，線性方程和相關(guān)系數(shù)見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗結(jié)果表

2.3 回收率及精密度實驗

以實驗室已檢甜油樣品1號為代表樣品，分別按照高、中、低3個濃度添加5種添加劑，按優(yōu)化的色譜條件進(jìn)行平行6次分析，考察本方法的回收率和精密度，結(jié)果見表3。

表3 回收率及精密度表（n=6）

2.4 樣品測定

采用優(yōu)化后的色譜條件，按照1.3中的前處理方法對實驗室已采用國家標(biāo)準(zhǔn)方法對5種添加劑分別檢測的3個樣品進(jìn)行重新檢測，檢測結(jié)果比對見表4。檢出量的偏差均小于5.0%。

表4 新建方法與國家標(biāo)準(zhǔn)方法檢測結(jié)果對比表

3 結(jié)論

采用蛋白沉淀劑的前處理方法，能有效去除基質(zhì)影響，樣品添加回收率良好。同時新方法可以快速同時測定5種添加劑，各組分之間分離好、峰形佳、檢出限符合國家限度要求，且3批樣品的測定結(jié)果與使用國家標(biāo)準(zhǔn)分別測定五種添加劑的結(jié)果一致，大大提高了工作效率。