大豆過敏原檢測研究

◎ 趙小明

（湯臣倍健股份有限公司，廣東 珠海 519040）

大豆[Glycine max (Linn.) Merr.]屬于豆科植物的一種，數(shù)千年來一直被人類當(dāng)作食物來食用。大豆中含有很多營養(yǎng)物質(zhì)，約含有蛋白質(zhì)39%，其中，部分是過敏原成分，如甘氨酸m3、m4，大豆球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制劑。

大豆產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)，作為增稠劑、乳化劑和蛋白填充機(jī)。對大豆過敏的人群必須嚴(yán)格避免食用大豆或含有大豆的食物。在食品生產(chǎn)加工過程中由于交叉污染會造成大豆殘留在食物中很難排除，因此高靈敏度的檢測方法對于大豆食品檢測必不可少[1]。

1 檢測原理

大豆檢測試劑盒應(yīng)用夾心法酶聯(lián)免疫吸附原理（ELISA），提取緩沖液萃取的大豆蛋白與包被在微孔表面的大豆胰蛋白酶抑制劑（STI）抗體反應(yīng)。樣品提取液或標(biāo)準(zhǔn)品加入到抗體包被的微孔中，大豆胰蛋白酶抑制劑將會結(jié)合到抗體上，經(jīng)過一次洗板之后將大豆胰蛋白酶抑制劑抗體酶聯(lián)偶合物加入到微孔上進(jìn)行孵育培養(yǎng)。第二次洗板之后將酶底物加入，顏色變?yōu)樗{(lán)色。且顏色深淺與樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中大豆胰蛋白酶抑制劑含量成正比。加入反應(yīng)終止液終止反應(yīng)后，反應(yīng)液顏色應(yīng)由藍(lán)色轉(zhuǎn)為黃色。在450 nm（OD450）濾鏡及630 nm示差濾鏡下使用酶標(biāo)儀測量微孔板吸光度值。以標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值對標(biāo)準(zhǔn)品濃度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣品吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值比較進(jìn)行結(jié)果判讀。

2 注意事項

注意事項如下：①試劑盒不使用時需放置在2～8 ℃保存，并確保在有效期內(nèi)使用。②嚴(yán)格遵守說明書中注明的操作時間進(jìn)行孵育，否則將導(dǎo)致實(shí)驗結(jié)果不精準(zhǔn)。③為了避免交叉污染，樣品制備前必須將所有儀器徹底清洗。④反應(yīng)終止液中含酸，避免直接接觸皮膚及眼睛。若不小心濺到，及時用水沖洗。⑤在實(shí)驗中應(yīng)當(dāng)自始至終穿戴橡膠手套、安全眼鏡及實(shí)驗外套。⑥檢測完后需對所有材料、容器及設(shè)備作適當(dāng)處理。

3 試劑準(zhǔn)備

試劑準(zhǔn)備如下：①提取緩沖液；用去離子水按照1∶10的比例稀釋濃縮提取緩沖液，配制好的稀釋緩沖液儲存在4 ℃條件下，可以穩(wěn)定保存1周。②清洗緩沖液；緩沖液放在冷凍條件下儲存將會有晶體狀沉淀，濃縮的緩沖液需要回溫使其完全溶解，然后再與去離子水按照1∶10的比例稀釋。配制好的稀釋緩沖液儲存在4 ℃條件下，可以穩(wěn)定保存1周。

4 操作步驟

操作步驟如下：①獲取具有代表性的樣品，取5 g樣品放在勻漿機(jī)或攪拌器上磨碎混勻。②稱取1 g混勻樣品，與20 mL稀釋提取緩沖液渦旋混勻。③在60 ℃水浴鍋中孵育15 min，每2 min充分振蕩混勻一次。④2 000 r·min-1，離心10 min獲得上清液，如果上清液中仍有顆粒物質(zhì)，需要重新過濾上清液收集濾液；或者直接用濾紙過濾提取液，收集濾液準(zhǔn)備檢測。⑤測試樣品的準(zhǔn)備。取無顆粒上清液100 μL于孔中進(jìn)行檢測，如果樣品中的過敏原含量超出定量范圍，需要增加稀釋比例，在計算樣品中的濃度時需要將額外的稀釋比例考慮在內(nèi)。

5 檢測流程

檢測流程如下；在使用前，所有試劑及試劑盒內(nèi)的材料必須恢復(fù)至室溫（18～30）℃。建議若使用8道移液槍進(jìn)行操作，在一次試驗中樣品及標(biāo)準(zhǔn)品的總量不超過48個（6條微孔）；若使用單道移液槍進(jìn)行操作，在任何一次實(shí)驗中樣品及標(biāo)準(zhǔn)品的總量不要超過16個（2條微孔）。①將等量有抗體包被的微孔條放入微孔板架上，未使用的有抗體包被的微孔條需放回裝有干燥劑的原鋁箔袋內(nèi)并密封保存。②使用單道移液器吸取準(zhǔn)備好的樣品或者標(biāo)準(zhǔn)品100 μL于抗體微孔中，每移取一個標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，單道移液槍必須更換新吸頭。注意確保最后將吸頭中的液體排空。③室溫條件下孵育20 min，不要搖動微孔板，以免引起孔與孔之間的污染。④將孔中的液體甩入水槽中，用300 μL沖洗緩沖液沖洗每個孔，然后將微孔中的水甩入水槽中。如此反復(fù)沖洗3次。注意：在沖洗過程中不要將微孔條從微孔板架上取下，每條微孔條帶應(yīng)被固定在微孔板架上。⑤第3次洗板完畢后，將幾張吸水紙巾放置在平整的桌面上，使微孔板倒置扣在紙面上，以盡可能地將殘留的水分排出。用干布或紙巾擦干微孔板底反面的水珠。⑥按照約120 μL/孔或1 mL/條的體積計算所需的酶聯(lián)偶合物用量。從綠色瓶蓋的瓶內(nèi)量取所需用量的酶聯(lián)偶合物至另外一個獨(dú)立的容器中（例如適用于8道移液槍的試劑槽中），移取100 μL酶聯(lián)偶合物至每個微孔中。⑦按照120 μL/孔或1 mL/條的體積計算所需的底物用量。從藍(lán)色瓶蓋的瓶內(nèi)量取所需用量的酶底物至一個底物試劑槽中（例如適用于8道移液槍的試劑槽中），移取100 μL酶底物至每個微孔中，室溫避光孵育20 min。⑧按照120 μL/孔或1 mL/條的體積計算所需的終止液用量。從紅色瓶蓋的瓶中量取所需用量的終止液至一個終止液試劑槽中（例如適用于8道移液槍的試劑槽中），依序（順序與加入底物的順序相同）向每個微孔中加入100 μL終止液終止反應(yīng)。顏色應(yīng)由藍(lán)變黃。⑨用酶標(biāo)儀在450 nm濾鏡及示差濾鏡630 nm下讀取結(jié)果，記錄每個微孔的吸光度OD值。在讀取數(shù)據(jù)前，微孔中應(yīng)沒有氣泡，否則將影響分析結(jié)果。

另需注意：不能將任何未使用的或用剩的試劑倒回原裝瓶中。檢驗過程中應(yīng)分清樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的位置。且在整個檢驗過程中，任何時候都不允許搖動微孔板以混合孔內(nèi)液體。

6 結(jié)果判讀

直接用標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值或者用相對于1 000 μg·kg-1標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值的百分?jǐn)?shù)建立5個標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。由于各標(biāo)準(zhǔn)品中的大豆胰蛋白酶抑制劑含量已知，則未知樣品大豆胰蛋白酶抑制劑的濃度即可通過此標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得。結(jié)果也可通過RomerLog/Logit軟件計算得出，如果使用Log/Logit軟件計算結(jié)果，其標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)不得低于0.985，若標(biāo)準(zhǔn)品1 000 μg·kg-1的吸光度值低于0.7，即表示試劑已變質(zhì)，請勿繼續(xù)使用；若樣品所含大豆胰蛋白酶抑制劑濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品的最高濃度（＞1 000 μg·kg-1），則需將提取過濾的溶液利用更多的提取緩沖液稀釋到試劑盒檢測范圍40～1 000 μg·kg-1以內(nèi)，重新檢測以得到精確結(jié)果。在最后的結(jié)果計算中，注意要將稀釋倍數(shù)算入。

此試劑盒是用于對樣品中大豆胰蛋白酶抑制劑的測定，而大豆胰蛋白酶抑制劑只是大豆蛋白的一種，若要進(jìn)行其他特殊蛋白產(chǎn)品的測定可參考表1的驗證數(shù)據(jù)。

表1 大豆衍生品中大豆產(chǎn)品含量的測量參考數(shù)據(jù)表

7 檢測結(jié)果

選取本公司所生產(chǎn)的可能含大豆過敏原的品種原料以及生產(chǎn)設(shè)備、清潔洗滌水進(jìn)行檢測（試劑檢出限：0.24 mg·kg-1），其結(jié)果如表 2。

表2 可能含有大豆過敏原的樣品檢測表

通過檢測證明湯臣倍健股份有限公司產(chǎn)品所含大豆過敏原是合格的，不會給一般食用人員帶來潛在危害。

8 結(jié)語

通過對食品或保健食品中所含大豆過敏原的檢測，能夠提前發(fā)現(xiàn)食品安全風(fēng)險，防止給具有此類過敏體質(zhì)的食用人群帶來安全風(fēng)險。