RANK基因甲基化與新疆不同民族老年男性高密度脂蛋白膽固醇的相關(guān)性

塔吉古麗·木沙，向紅，白雪，李楊靜，王紅梅

（新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院干部保健二科，烏魯木齊830001）

血脂異常是心腦血管疾病的獨(dú)立而重要的危險(xiǎn)因素，它所引起的各種嚴(yán)重疾病已經(jīng)成為很多國家的重要致死和致殘?jiān)?，因此積極調(diào)脂治療對(duì)減少心腦血管疾病的發(fā)生有著非常重要的意義。

研究表明，血脂異常的發(fā)病與遺傳因素和環(huán)境因素有關(guān)［1］。表觀遺傳學(xué)修飾可導(dǎo)致遺傳性的表型變異［2］，其中DNA甲基化是表觀遺傳修飾的一種主要修飾方式［3］，是可逆的DNA自然化學(xué)的修飾方式。環(huán)境因素可能通過影響表觀遺傳修飾的變化，導(dǎo)致血脂異常。國內(nèi)對(duì)核因子KB受體活化因子（RANK）基因甲基化的研究較少。本研究旨在探討RANK基因甲基化在新疆老年男性中的分布情況，及其甲基化程度與高密度脂蛋白膽固醇的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究是以自然人群橫斷面流行病學(xué)調(diào)查為基礎(chǔ)的病例—對(duì)照研究。即采用多級(jí)隨機(jī)抽樣的方法。2018年4月至2018年5月，對(duì)新疆木壘縣和洛浦縣有本地正式戶口且65歲以上的長住漢族、維吾爾族、哈薩克族居民進(jìn)行流行病學(xué)現(xiàn)況調(diào)查。調(diào)查前事先登記人口，保證應(yīng)答率，保證入選個(gè)體均為無關(guān)個(gè)體。調(diào)查采用問卷調(diào)查方法，調(diào)查工作主要由經(jīng)過統(tǒng)一培訓(xùn)的的專職人員填寫表格、詢問病史。所有研究對(duì)象均收集一般資料，抽取空腹?fàn)顟B(tài)下全血5 mL，現(xiàn)場離心分離血清和血液有形成分，血清在采血后1個(gè)月內(nèi)檢測(cè)血脂［包括總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、HDL-C、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）］、空腹血糖（FBG）、空腹胰島素（FIns）等生化指標(biāo)，血液有形成分在-80℃保存，以提取DNA。生化檢測(cè)均在新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科完成并由專人負(fù)責(zé)。

在以上獲得人群樣本中隨機(jī)抽樣，最后共有32位漢族、28位維吾爾族、30位哈薩克族老年男性入選本研究。

按《中國成人超重和肥胖癥預(yù)防控制指南》標(biāo)準(zhǔn)診斷中心性肥胖：男性腰圍≥85 cm、女性腰圍≥80 cm者為中心性肥胖。按照《中國成人血脂異常防治指南》標(biāo)準(zhǔn)診斷低高密度脂蛋白膽固醇血癥：HDL-C＜1 mmol／L的個(gè)體判斷為低高密度脂蛋白膽固醇血癥。

在入選研究對(duì)象中，漢族低高密度脂蛋白膽固醇血癥組（病例組）共18例、對(duì)照組14例；維吾爾族低高密度脂蛋白膽固醇血癥組（病例組）共16例、對(duì)照組12例；哈薩克族低高密度脂蛋白膽固醇血癥組（病例組）共16例、對(duì)照組14例。

所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。本研究通過新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查并同意實(shí)施。

1.2 研究方法

1.2.1 外周血基因組DNA提取 抽取受試者外周血5 mL，-80℃保存。應(yīng)用PAXgene Blood DNA kit試劑盒（QIAGEN，德國），并按照試劑盒中提供的“操作說明”中的標(biāo)準(zhǔn)操作步驟提取外周血基因組DNA。

1.2.2 RANK啟動(dòng)子區(qū)甲基化檢測(cè) 使用Methyl Primer Express v1.0設(shè)計(jì)重亞硫酸鹽測(cè)序引物：上游引物 5′-GGTGCCTTTCTAGAATTTGGTGG-3′；下 游引 物：5′-CCAACCCTAAATTACCCTTCAC-3′，PCR產(chǎn)物長度376 bp，共20個(gè)CpG位點(diǎn)。

應(yīng)用 EpiTect Fast Bisulfite Conversion Kits（QIAGEN，德國）進(jìn)行基因組甲基化修飾，并對(duì)修飾后的DNA進(jìn)行反復(fù)洗脫、純化，洗脫純化的DNA放入-20℃保存。取質(zhì)檢合格的上述基因組DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收?；厥盏腜CR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工測(cè)序，并采用BiQ Analyzer分析軟件對(duì)RANK基因組標(biāo)準(zhǔn)序列和測(cè)序序列進(jìn)行比對(duì)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料用x±s表示，計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)或者百分?jǐn)?shù)表示。組間臨床表型計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)（兩組間）或單因素方差分析（3組間），分類資料采用χ2檢驗(yàn)。并采用協(xié)方差分析，在校正年齡、吸煙、飲酒、血脂及高血壓、糖尿病患病率后，分析對(duì)照組、病例組RANK基因CpG島甲基化率差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 新疆漢族、維吾爾族、哈薩克族老年男性研究對(duì)象臨床特征 在漢族研究對(duì)象中，病例組、對(duì)照組間高血壓患病率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在哈薩克族研究對(duì)象中，病例組、對(duì)照組間的高血壓患病率、肥胖患病率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 新疆漢族、維吾爾族、哈薩克族老年男性RANK基因甲基化率差異 在新疆漢族、維吾爾族、哈薩克族老年男性中，RANK基因CpG島甲基化率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

2.3 RANK基因甲基化與新疆漢族、維吾爾族、哈薩克族老年男性高密度脂蛋白膽固醇相關(guān)性 在新疆維吾爾族、哈薩克族老年男性中，對(duì)照組RANK基因CpG島甲基化率低于病例組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在漢族老年男性中，對(duì)照組RANK基因CpG島甲基化率低于病例組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表1 新疆漢族、維吾爾族、哈薩克族研究對(duì)象臨床資料分析

表2 新疆漢族、維吾爾族、哈薩克族老年男性RANK基因甲基化率差異

采用協(xié)方差分析，校正年齡、吸煙、飲酒及高血壓、糖尿病、肥胖患病率后，在新疆維吾爾族、哈薩克族老年男性中，對(duì)照組RANK基因CpG島甲基化率低于病例組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 新疆漢、維吾爾、哈薩克族高密度脂蛋白膽固醇與RANK基因甲基化相關(guān)性分析

3 討論

血清HDL-C水平反映了遺傳和環(huán)境因素間的相互作用，據(jù)研究報(bào)道，50%以上人類HDL-C水平的變異由遺傳因素所引起［4］。DNA甲基化是一種可遺傳性的、與心腦血管危險(xiǎn)因素相關(guān)的可修飾的表觀遺傳標(biāo)記，而且人類基因組約70%的CpG位點(diǎn)存在甲基化。脂質(zhì)代謝的調(diào)控基因眾多，本研究的目的是識(shí)別與血清脂質(zhì)水平相關(guān)的DNA甲基化差異位點(diǎn)。本研究通過在新疆維吾爾族、哈薩克族、漢族自然人群中的研究發(fā)現(xiàn)，新疆維吾爾族、哈薩克族老年低高密度脂蛋白膽固醇血癥可能與RANK基因甲基化率變異有關(guān)，RANK基因甲基化率增高可能是低高密度脂蛋白膽固醇血癥的危險(xiǎn)因素。

護(hù)骨素（OPG）、RANK和其配體-核受體KB激活受體配體（RANKL）是 RANKL／RANK／OPG信號(hào)通路中的三個(gè)主要蛋白。RANKL／RANK／OPG系統(tǒng)是一個(gè)成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞相互作用的信號(hào)通道，在調(diào)節(jié)骨代謝過程中起很關(guān)鍵的作用。近年來隨著研究的進(jìn)一步深入，發(fā)現(xiàn)RANKL／RANK／OPG不僅在參與調(diào)節(jié)骨代謝，在免疫、炎癥、動(dòng)脈粥樣硬化、血管鈣化、細(xì)胞凋亡及腫瘤轉(zhuǎn)移等方面均起著重要的作用，它還參與了人體內(nèi)許多疾病發(fā)生發(fā)展的重要病理生理過程，如冠心病、外周動(dòng)脈疾病、高血壓、糖尿病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等［5-7］。另一項(xiàng)研究報(bào)道，通過阻斷RANKL／RANK／OPG信號(hào)通路能夠改善胰島素抵抗，可能預(yù)防糖尿病的發(fā)生［8］。

研究發(fā)現(xiàn)，RANKL／RANK／OPG在脂肪代謝中發(fā)揮重要作用［9-11］，OPG可能通過調(diào)節(jié)脂肪酸攝取基因CD36、核受體基因PPARγ、ERK信號(hào)通路調(diào)節(jié)三酰甘油［12］。而在本研究中。也發(fā)現(xiàn)低高密度脂蛋白膽固醇血癥可能與RANK基因CpG島甲基化水平增高存在有相關(guān)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。此外，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在維吾爾族、哈薩克族老年人群中，低高密度脂蛋白膽固醇血癥患者中RANK基因CpG島甲基化水平升高（P＜0.05），但在漢族人群中沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析其原因，考慮多種因素有關(guān)：DNA甲基化不是靜止的穩(wěn)定狀態(tài)，而是能夠受到外界刺激發(fā)生變化的動(dòng)態(tài)過程，研究提示孕婦產(chǎn)前、產(chǎn)后營養(yǎng)狀況均可影響DNA甲基化及組蛋白修飾進(jìn)而影響免疫及代謝系統(tǒng)［13］；另有研究表明：高脂肪飲食、年齡、環(huán)境均會(huì)影響DNA甲基化程度的改變［14-15］，維吾爾族、哈薩克族人群具有特殊的膳食習(xí)慣和生活方式，膳食中主要以肉制品和奶制品為主，高脂肪、高蛋白及高嘌呤飲食在膳食中占較大的比例，魚類和蔬菜水果的攝入量相對(duì)較少。維吾爾族膳食結(jié)構(gòu)中糧谷類、畜禽肉類及水果類攝入量達(dá)到或接近中國居民平衡膳食寶塔（2016）要求；蔬菜類及蛋類的攝入量低于寶塔建議值；油脂、乳類及鹽類的攝入量高于寶塔建議值［16］。故此研究結(jié)果還需要進(jìn)行深入研究及大樣本實(shí)驗(yàn)研究的驗(yàn)證。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)RANK基因的甲基化率增高可能與新疆維吾爾族、哈薩克族老年男性低高密度脂蛋白膽固醇血癥相關(guān)，為探討低高密度脂蛋白膽固醇血癥發(fā)生發(fā)展的可能遺傳機(jī)制提供了依據(jù)。當(dāng)然，由于基因的表達(dá)受到翻譯、轉(zhuǎn)錄、蛋白合成過程中多種因素的影響和調(diào)控，所以RANK基因甲基化在脂質(zhì)代謝中的作用還有待于進(jìn)一步研究。