響應面法優(yōu)選知母須根總黃酮提取工藝及其解熱作用研究

黃 琪，李麗麗，吳德玲*，金傳山，許鳳清

1安徽中醫(yī)藥大學藥學院；2安徽省現(xiàn)代中藥重點實驗室，合肥 230012

知母為百合科植物知母(AnemarrhenaasphodeloideBunge.)的干燥根莖，具有清熱解毒、瀉火滋陰等功效[1]。其須根是知母產(chǎn)地加工過程中產(chǎn)生的廢棄物，總量占根莖采收總量的30%左右，知母須根的廢棄不用造成了一定程度的環(huán)境污染和資源浪費。課題組前期研究表明知母須根中主要含有黃酮類、甾體皂苷、多糖等化學成分[2,3]。

天然植物中的黃酮類成分大多具有較好的解熱、抗炎的藥理活性[4,5]，且有文獻研究表明知母須根和主根具有相近的化學成分組成[6]。為更好的利用知母須根這一資源，本研究以知母須根為研究對象，以響應面法優(yōu)選知母須根總黃酮提取工藝，以干酵母致熱大鼠模型研究其解熱作用，以探討其解熱的作用機制，為知母須根深度開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

紫外可見分光光度計(上海美譜達儀器有限公司，中國，UV1600)，酶標儀(賽默飛世爾科技公司，美國)。腫瘤壞死因子-α、白介素-6、前列腺素E-2、精氨酸升壓素等試劑盒均購于上海谷研實業(yè)有限公司，芒果苷對照品(成都領航者生物科技有限公司，中國，批號：4773-96-0)。阿司匹林腸溶片(南京白敬宇制藥有限公司，中國，批號：國藥準字H32026500)。

安琪高活性干酵母(安琪酵母股份有限公司，中國，批號：GB/T20886)。

1.2 藥材與實驗動物

1.2.1 藥材

知母須根2017年11月份收集于安徽廣印堂中藥飲片股份有限公司知母種植基地，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學金傳山教授鑒定為百合科植物知母(AnemarrhenaasphodeloideBunge.)的須根。

1.2.2 實驗動物

實驗用SPF級SD大鼠(周齡8周，雌雄各半，180～220 g)購于安徽醫(yī)科大學實驗動物中心(許可證號：scxk(皖)2017-001)，實驗前適應性喂養(yǎng)3天。

1.3 標準曲線的繪制

1.4 知母須根總黃酮提取工藝及提取量的測定

精密稱定知母須根粉末1 g于具塞錐形瓶中，加入適量溶劑進行超聲提取，分別考察不同的乙醇濃度、料液比、提取時間和提取次數(shù)對知母須根總黃酮提取量的影響，根據(jù)1.3項下的線性方程測定總黃酮含量并計算總黃酮的提取量?？傸S酮提取量(mg/g)=提取液中總黃酮含量/藥材重×100%。

1.4.1 單因素實驗

1.4.1.1 乙醇濃度對知母須根總黃酮提取量的影響

固定超聲時間為30 min，料液比為1∶40，提取次數(shù)為1次，考察乙醇濃度分別為10%、30%、50%、70%、90%等五個水平對知母須根總黃酮提取量的影響，每個因素平行實驗5次。實驗結果見圖1。

1.4.1.2 提取時間對知母須根總黃酮提取量的影響

固定乙醇濃度為70%，料液比為1∶40，提取次數(shù)為1次，考察超聲提取時間為20、30、40、50、60 min等五個水平對知母須根總黃酮提取量的影響，每個因素平行實驗5次。實驗結果見圖2。

1.4.1.3 料液比對知母須根總黃酮提取量的影響

固定乙醇濃度為70%，提取次數(shù)為1次，超聲提取時間為40 min，考察料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70等七個水平對知母須根總黃酮提取量的影響，每個因素平行實驗5次。實驗結果見圖3。

1.4.1.4 提取次數(shù)對知母須根總黃酮提取量的影響

固定乙醇濃度為70%，超聲提取時間為40 min，料液比為1∶50，分別考察提取次數(shù)為1、2、3、4、5等對知母須根總黃酮提取量的影響，每個因素平行實驗5次。實驗結果見圖4。

1.4.2 響應面法優(yōu)選知母須根總黃酮提取工藝

在單因素實驗基礎上，選取1.4.1項下影響總黃酮提取量的四個因素進行Box-Behnken試驗設計，以總黃酮提取量為指標，優(yōu)選最佳提取條件，因素水平見表1。

1.5 總黃酮提取物的解熱作用研究

1.5.1 發(fā)熱動物模型建立、動物分組及給藥

1.5.1.1 干酵母混懸液配制

取干酵母15 g于研缽中，緩慢加入蒸餾水90 mL并研磨至均勻的混懸液，將混懸液倒入燒杯中，然后取10 mL蒸餾水洗滌研缽內(nèi)壁，最終制備成15%的干酵母混懸液。

1.5.1.2 發(fā)熱動物模型建立

發(fā)熱模型建立：將大鼠適應性喂養(yǎng)3天，外部保持環(huán)境不變，每日用電子體溫計測量肛溫2～3次，使其適應電子體溫計，取體溫于37.0～38.0 ℃且體溫變化小于0.3 ℃的大鼠供實驗造模用。隨機取大鼠若干，每只進行背部皮下注射15%的干酵母混懸液(10 mL/kg)，每隔1 h測定一次肛溫，以基礎體溫上升1 ℃(5 h后)以上的為發(fā)熱鼠，視為造模成功。

表1 Box-Behnken 試驗設計因素水平表Table 1 Factor levels used in Box-Behnken design

1.5.1.3 動物分組及給藥

將已測定肛溫的實驗大鼠隨機分5組(正常組、模型組、阿司匹林(陽性藥)組、知母須根總黃酮提取物組)，每組10只。前期研究表明，知母須根總黃酮提取物在劑量為4 g/kg時即可發(fā)揮解熱作用。實驗用陽性藥為阿司匹林，給藥劑量為0.1 g/kg，給藥方式為灌胃給藥。

給藥組先用知母須根總黃酮提取物組連續(xù)灌胃給藥三天，第四天造模，造模后再灌胃知母須根總黃酮提取物一次，分別于造模前、造模后、末次給藥0.5、1、2、3、4、5 h測量各組大鼠肛溫。

1.5.2 大鼠血清及下丘腦中細胞因子的測定

待大鼠體溫測定后，腹腔注射15%的水合氯醛溶液1 mL/100 g麻醉大鼠，分別進行腹主動脈取血及分離大鼠下丘腦。全血以3 000 rpm離心15 min，取上清液；下丘腦樣本稱定重量后用生理鹽水研磨成10%的下丘腦勻漿；按照試劑盒的要求測定血清及下丘腦中TNF-α，IL-6，AVP，PGE-2水平。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

由實驗結果可知，芒果苷在0.83～1.49 μg/mL之間質(zhì)量濃度與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關系，線性方程為y= 0.386 7x+ 0.077 2(r=0.999 5)。結果見圖1。

2.2 各因素對總黃酮提取量的影響

由實驗結果(圖2)可知，不同乙醇濃度、提取時間、料液比、提取次數(shù)對知母須根總黃酮提取量均有影響。單因素實驗結果顯示，以70%乙醇作為最佳提取溶劑，最佳料液比為1∶50，最佳提取時間為40 min，最佳提取次數(shù)為2次。

圖1 芒果苷對照品線性關系Fig.1 Linear relationship of Mangiferin

2.3 響應面試驗數(shù)據(jù)分析

根據(jù)“2.2”項下單因素實驗優(yōu)選出的最佳因素水平，選取乙醇濃度，提取時間，料液比，提取次數(shù)等四個因素，采用Box-Behnken進行試驗設計，實驗共29組，每組實驗共平行三份，探討各因素水平對超聲提取知母須根總黃酮提取量的影響，結果見表2。本設計方案中A、B、C、D為三維空間的頂點，構成析因點，析因設計實驗共12組；區(qū)域中心點為零點，零點實驗編號為3、11、13、17、19共5組，作為中心設計實驗，可對實驗誤差進行估算。最終擬合的總黃酮提取量(Y)的二次多項式方程為：

Y=53.62-3.98A-0.022B+0.18C+5.39D-0.73AB-0.46AC+6.71AD-0.090BC-1.22BD-0.075CD-16.89A2-3.48B2-3.12C2-4.92D2

本模型的一次項、二次項等項方差分析結果及模型的決定系數(shù)能夠反映該分析模型是否可靠，結果見表3。該模型的P<0.05，有一定的著性，另外該模型的校正決定性系數(shù)RAdj2=0.504 9，說明該模型對知母須根總黃酮成分超聲提取實驗的擬合程度好，可靠性較高，能夠?qū)嶒灁?shù)據(jù)進行解釋分析。由A、B、C、D各因素的F值可知，影響知母須根總黃酮提取量的因素從高至低依次是提取次數(shù)(D)、乙醇濃度(A)、提取時間(B)、液料比(C)。

由響應面圖與等高線圖結果顯示，固定液料比與提取次數(shù)，總黃酮提取量隨著乙醇濃度和提取時間的同時增加呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，由等高線圖可看出，乙醇濃度所呈現(xiàn)的等高線分布較為密集，說明乙醇濃度在總黃酮提取量上較提取時間的影響大，由等高線橢圓的規(guī)則程度可以判斷，乙醇濃度和提取時間有較為顯著的交互作用，另外當乙醇濃度不變時，隨著提取時間的增加總黃酮提取量呈現(xiàn)下降趨勢，可能原因為部分黃酮類成分在超聲過程中結構受到了破壞或發(fā)生了轉(zhuǎn)變，故提取時間不宜過長。由此可得即當乙醇濃度為58%～77%時，提取時間為40 min時，知母須根總黃酮響應值最高。固定提取時間與提取次數(shù)，隨著乙醇濃度和液料比的同時增加總黃酮提取量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，根據(jù)分析，當乙醇濃度為58%～77%時，液料比為45～55 mL/g時，知母須根總黃酮響應值最高。分析比較并模擬出最佳提取工藝：乙醇濃度為70%，提取時間40 min，液料比為50 mL/g，提取次數(shù)2次。在此條件下，知母須根總黃酮成分含量的預測值為53.62 mg/g。

圖2 不同因素對知母須根總黃酮提取量(mg/g)的影響Fig.2 Effects of different factors on Total Flavonoids (mg/g) Extracted from the fibrous root of Anemarrhena asphodeloides 注：A：乙醇濃度；B：超聲提取時間；C：料液比；D：提取次數(shù)Note:A:the ethanol concentration;B:the extraction time;C:the material liquid ratio;D:the extraction times

表2 響應面實驗結果Table 2 The Results of Response Surface Experiment

續(xù)表2(Continued Tab.2)

編號No.A乙醇濃度Ethanol concentration(%)B提取時間Extraction time(min)C料液比Material-liquid ratio(mL/g)D提取次數(shù)Extraction times總黃酮提取量Contet of total flavonoids(mg/g)20903050229.1621504060233.6222503050230.1723504050335.4424705050135.1325705060250.9726705040250.4827703060252.2328904040230.4329704040354.45

表3 方差分析結果Table 3 The results of variance analysis

2.4 驗證試驗結果

根據(jù)所擬合的最佳提取條件進行驗證試驗，共平行3次，所得知母須根總黃酮含量為53.79 mg/g，與模型預測值53.62 mg/g接近，表明該模型重現(xiàn)性良好。

圖3 乙醇濃度和提取時間對知母總黃酮提取量影響的響應面圖和等高線圖Fig.3 The effects of ethanol concentration and extraction time on the extraction of total flavonoids from the fibrous root of Anemarrhena by response surface methodology and contour map

圖4 乙醇濃度和液料比對知母總黃酮提取量影響的響應面圖和等高線圖Fig.4 The effects of ethanol concentration and liquid to material ratio on the extraction of total flavonoids from the fibrous root of Anemarrhena by response surface methodology and contour map

圖5 乙醇濃度和提取次數(shù)對知母總黃酮提取量影響的響應面圖和等高線圖Fig.5 The effects of ethanol concentration and extraction times on the extraction of total flavonoids from the fibrous root of Anemarrhena by response surface methodology and contour map

圖6 提取時間和液料比對知母總黃酮提取量影響的響應面圖和等高線圖Fig.6 The effects of extraction times and on the extraction of total flavonoids from the fibrous root of Anemarrhena by response surface methodology and contour map

圖7 提取時間和提取次數(shù)對知母總黃酮提取量影響的響應面圖和等高線圖Fig.7 The effects of extraction duration and liquid to material ratio on the extraction of total flavonoids from the fibrous root of Anemarrhena by response surface methodology and contour map

圖8 液料比和提取次數(shù)對知母總黃酮提取量影響的響應面圖和等高線圖Fig.8 The effects of extraction liquid to material and ratio times on the extraction of total flavonoids from the fibrous root of Anemarrhena by response surface methodology and contour map

2.5 大鼠體溫測定結果

實驗結果(見表4)顯示造模后5 h內(nèi)，與正常組相比，模型組大鼠體溫顯著升高(P<0.01)，表明造模成功。知母須根總黃酮提取物在末次給藥5 h后與模型組相比體溫顯著下降(P<0.05)，表明知母須根總黃酮提取物有一定的解熱作用。

組別Group劑量Dose(g/kg)造模前Before modeling造模后Aftermodeling給藥后體溫Body temperature after administration(℃)0.5 h1 h2 h3 h4 h5 h正常組 Control-37.61±0.2437.52±0.1837.61±0.1337.65±0.1937.64±0.2437.62±0.2437.64±0.1237.41±0.21模型組 Model-37.80±0.2639.43±0.28##39.62±0.25##39.40±0.29##39.41±0.19##39.27±0.17##39.15±0.18##39.22±0.19##阿司匹林組 Asprin0.137.92±0.2239.41±0.1838.84±0.1538.33±0.19?37.92±0.19??37.91±0.15??37.64±0.28??37.73±0.28??總黃酮提取物 TF4.037.84±0.1639.37±0.2939.44±0.2139.17±0.2439.17±0.2339.13±0.2139.03±0.2338.38±0.29?

注：與正常組相比##P<0.01，與模型組相比**P<0.01，*P<0.05。
Note:##P<0.01vs control group,**P<0.01，*P<0.05 vs model group.

2.5 血清中相關細胞因子的測定

血清中相關因子測定結果顯示，與正常組相比，模型組大鼠血清中TNF-α、PGE-2、IL-6、AVP含量顯著升高。與模型組相比，知母須根總黃酮提取物可降低血清中TNF-α、PGE-2(P<0.05)及IL-6(P<0.001)的含量，升高血清AVP(P<0.05)的含量。

組別 GroupTNF-α (ng/L) PGE-2 (ng/L) IL-6 (ng/mL) AVP (ng/L) 正常組 Control613.22±56.29314.77±62.3392.87±5.9934.39±4.50模型組 Model751.97±121.4#578.34±58.71###165.65±13.32###57.65±9.19###阿司匹林組 Asprin563.49±60.53??371.65±97.41???101.93±16.72???75.58±3.07???總黃酮提取物組 TF634.03±78.09?449.71±111.99?136.5±12.11???66.01±12.11?

注：與正常組相比#P<0.05，###P<0.001；與模型組相比*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
Note:#P<0.05，###P<0.001vscontrol group;*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vsmodel group.

2.6 大鼠下丘腦中相關細胞因子的測定

下丘腦中相關因子測定結果顯示，與模型組相比，知母須根總黃酮提取物可降低大鼠下丘腦中TNF-α(P<0.05)、IL-6、PGE-2(P<0.01)的含量，升高下丘腦中AVP(P<0.05)的含量。結果見表6。

組別GroupTNF-α (pg/mg) IL-6 (pg/mg) PGE-2 (pg/mg) AVP (pg/mg) 正常組 Control594.8±59.3128.3±33.1398.9±117.833.9±7.7模型組 Model726.7±107.2##201.0±41.6##748.5±110.9##43.9±5.9##阿司匹林組 Asprin604.5±51.8??116.3±18.4??512.8±67.9??65.4±6.6??總黃酮提取物組 TF620.6±76.2?126.9±19.1??568.5±71.7??50.3±5.1?

注：與正常組相比#P<0.05，##P<0.01;與模型組相比*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
Note:#P<0.05,##P<0.01vs control group;*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 vs model group.

3 結論

本文采用了Box-Behnken方法優(yōu)選出知母須根總黃酮最佳提取工藝為乙醇濃度70%，提取時間40 min，液料比50 mL/g，提取次數(shù)2次。解熱實驗研究表明，知母須根總黃酮提取物具有一定的解熱作用，其解熱機制可能是通過降低發(fā)熱大鼠模型血清中TNF-α、PGE-2、IL-6的含量、升高發(fā)熱大鼠模型血清中AVP的含量而發(fā)揮作用的。

芒果苷是知母須根中成分含量較高的一種黃酮苷類成分，且知母須根中各主要黃酮苷類成分在258 nm下均有較強紫外吸收[8]，因此選擇芒果苷為對照品具有合理性。超聲提取法具有操作簡便，提取時間短，提取效率高等優(yōu)勢，因此本文優(yōu)選出的最佳工藝具有較強的可操作性。

TNF-α是一種內(nèi)源性致熱原，是發(fā)熱疾病過程中的一個中間環(huán)節(jié)，模型組的大鼠血清TNF-α顯著升高，因此導致大鼠發(fā)熱[9,10]，PGE-2是體溫調(diào)節(jié)最主要的物質(zhì)，尤其是在感染性發(fā)熱中其含量會顯著升高，PGE-2與受體結合后影響體溫調(diào)節(jié)點水平，從而引起機體體溫的變化[11]，IL-6 是各種發(fā)熱的中間物質(zhì)，其生物學效應呈現(xiàn)多樣性，在發(fā)熱機制中具有舉足輕重的作用[12]。AVP是內(nèi)源性的解熱物質(zhì)，在機體發(fā)熱時機體會通過分泌AVP來保護機體[13]。本文研究結果表明知母須根總黃酮提取物可以顯著降低發(fā)熱大鼠血清及下丘腦中TNF-α、PGE-2、IL-6的含量，升高AVP的含量，表明知母須根總黃酮提取物具有一定的解熱作用。

知母須根是知母生長發(fā)育過程中的非藥用部位，其與知母主根從同一組織生長分化而來。知母藥性寒涼、具有清熱解毒之功，本文研究結果表明，知母須根總黃酮提取物也同樣具有一定的解熱作用，可為知母須根的綜合開發(fā)利用提供一定的依據(jù)。然而天然藥物中化學成分較多，其發(fā)揮藥效作用的機制復雜，知母須根總黃酮的解熱作用和化學成分尚需進一步研究。