兩種柳珊瑚Anthogorgia caerulea和Menella kanisa的化學(xué)成分及其抗海洋污損生物附著活性研究

蘇志維，易湘茜，鄧家剛，郝二偉，侯小濤，米順利，高程海

廣西中醫(yī)藥大學(xué)海洋藥物研究院 廣西中藥藥效研究重點實驗室 廣西北部灣海洋中藥應(yīng)用技術(shù)與產(chǎn)品研發(fā)實驗室，南寧 530200

近年來，海洋污損生物所造成的損失越來越嚴(yán)重，全球每年由海洋生物污損所造成的經(jīng)濟損失高達近百億美元[1]?；诜牢蹌┲瞥煞牢弁苛鲜乾F(xiàn)行最經(jīng)濟可行的手段。曾經(jīng)有機錫和氧化亞銅涂料是最有效的防污涂料，但是由于不易降解和三致效應(yīng)造成不良生態(tài)環(huán)境影響已被國際海事組織(IMO)禁止使用。因此，當(dāng)前迫切需要開發(fā)安全低毒且具選擇性的環(huán)境友好型抗污損劑以取代傳統(tǒng)的防污涂料。在海洋抗污損方面，海洋天然產(chǎn)物防污劑以其易降解、無毒、高效的優(yōu)勢倍受科研人員關(guān)注。目前，已從多種海洋動植物中獲得了一系列如甾類、萜類、肽類、生物堿類等具有抗海洋生物污損附著活性的海洋天然產(chǎn)物[2]。

柳珊瑚中蘊含著豐富的化學(xué)成分，至今為止已發(fā)現(xiàn)超過800個新化合物，其中不乏抗污損活性成分[3-5]。我國北部灣海域蘊藏著豐富的柳珊瑚資源[6-8],為了充分利用我國豐富的資源，進一步尋找新的抗污損活性成分，本文對北部灣兩種柳珊瑚的次生代謝產(chǎn)物進行了研究，并測試其抗海洋污損生物附著能力，從中發(fā)現(xiàn)了一個新的神經(jīng)酰胺類抗污損成分。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

BruckerAvance 600 型核磁共振波譜儀，TMS 為內(nèi)標(biāo)；waters 2695(PDA 檢測器，10 mm × 250 mm，5 um，Phenomenex)；N-1100 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)；薄層色譜硅膠與柱層析硅膠(青島海洋化工廠)；SephadexLH-20(Pharmacia Biotech．Sweden)；高效液相色譜用試劑為色譜純(德國MERCK公司)，顯色劑：5%硫酸乙醇溶液及5%磷鉬酸乙醇溶液、其他常規(guī)試劑均為分析純(廣東光華科技股份有限公司)。

1.2 生物材料

采自廣西潿洲島海域的兩種柳珊瑚，由中國科學(xué)院南海海洋研究所李秀寶博士鑒定為花柳珊瑚Anthogorgiacaerulea和小月柳珊瑚Menellakanisa，該標(biāo)本現(xiàn)存放于廣西中醫(yī)藥大學(xué)廣西海洋藥物研究院(樣品編號分別為2010-GXAS-003和2010-GXAS-004)。

1.3 抗污損生物幼蟲附著活性篩選

1.3.1 幼蟲的培養(yǎng)

藤壺(Barnacleamphitrite)成蟲采自廣西欽州港中石化碼頭的柱樁上，根據(jù)Thiyagarajan等[9]方法培養(yǎng)，獲取藤壺?zé)o節(jié)幼蟲后在28 ℃下用硅藻ChaetocerosgracilisSchutt喂養(yǎng)，在附著測試之前，處于介蟲狀態(tài)的藤壺幼蟲在8 ℃黑暗環(huán)境中放置 4 d。

1.3.2 抗幼蟲附著活性篩選

該方法參照本實驗室的操作方法進行[10]，將化合物1-7分別溶解于 DMSO 溶液中，用無菌海水配制成 100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.57 μg /mL 共7個濃度梯度。在 24 孔板的每個孔中加入 1 mL 配制好的測試樣品(采用 DMSO 溶解)和15±5個游動藤壺幼蟲，每個樣品做 4 個平行，加含有 1 mL DMSO 的無菌海水作為陰性對照。配有測試樣品的 24 孔板放于培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)溫度為 28 ℃，避光放置 24 h 后，觀察實驗結(jié)果。通過顯微鏡觀察逐個記錄已附著在板壁上的幼蟲個數(shù)和沒有附著在板壁上的幼蟲個數(shù)以及已死亡的幼蟲個數(shù)。統(tǒng)計已附著在板壁上的幼蟲個數(shù)占實驗用總幼蟲個數(shù)的百分比，通過 EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM Version 1.5 軟件計算受測化合物的 EC50和 LC50。

1.4 提取與分離

小月柳珊瑚Menellakanisa樣品(濕重約為3.08 kg)砍碎，用乙醇-二氯甲烷(V∶V=1∶1)混合溶劑浸泡三次，每次一周，將所得粗提物加水混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇各萃取三次，減壓回收試劑，得乙酸乙酯萃取物7.21 g，正丁醇萃取物18.59 g。

將乙酸乙酯萃取物裝柱裝入正相硅膠柱層析，采用CHCl3-Me2CO系統(tǒng)(CHCl3∶Me2CO=1∶0.1～1∶0.8/V∶V)和CHCl3-MeOH系統(tǒng)(CHCl3∶MeOH=1∶0.1～0∶1/V∶V)依次梯度洗脫，根據(jù)TLC法檢測結(jié)果，將成分相近的流份進行合并為11個組分C1-C11。組份C6(455mg)經(jīng)半制備高效液相色譜進行分離，獲得新化合物1(5.3mg)。

將正丁醇萃取物裝入正相硅膠柱層析，采用CHCl3-MeOH系統(tǒng)(CHCl3∶MeOH=1∶0.1～0∶1/V∶V)依次梯度洗脫，根據(jù)TLC法檢測結(jié)果，將成分相近的流份進行合并為8個組分D1-D8。組份D4(169 mg)經(jīng)半制備高效液相色譜進行分離，獲得化合物2(9 mg)，組分D6(446.1 mg)先經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱(CHCl3∶MeOH =1∶1/V∶V)分離后得流份d1～d7，d7再經(jīng)半制備高效液相色譜進行分離，獲得化合物3(3.3 mg)，化合物4(0.7mg)。

柳珊瑚Anthogorgiacaerulea(濕重約5.0 kg)切碎，用乙醇-二氯甲烷(V∶V=1∶1)混合溶劑浸泡三次，每次一周，將所得粗提物加水混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇各萃取三次，減壓回收試劑，得乙酸乙酯萃取物24.82 g，正丁醇萃取物16.28 g。

將乙酸乙酯萃取物裝入正相硅膠柱層析，采用CHCl3-Me2CO系統(tǒng)(CHCl3∶Me2CO=1∶0.1～1∶0.8)和CHCl3-MeOH系統(tǒng)(CHCl3∶MeOH=1∶0.1～ 0∶1/V∶V)依次梯度洗脫，根據(jù)TLC法檢測結(jié)果，將成分相近的流份進行合并，初步分為8個組分J1-J8。組份J7(254.1 mg)先用HPLC分析柱確定分離條件，再用HPLC半制備柱進行分離純化，在梯度MeOH∶H2O=90∶10/V∶V處，獲得化合物5(1.1 mg)。

將正丁醇萃取物裝入硅膠柱層析，采用CHCl3-MeOH系統(tǒng)(CHCl3∶MeOH=1∶0.1～0∶1/V∶V)依次梯度洗脫，根據(jù)TLC法檢測結(jié)果，將成分相近的流份進行合并，初步分為6個組分K1-K6。組份K4(385.6mg)經(jīng)HPLC半制備柱進行分離純化，獲得化合物6(1.2 mg)，組份K5(72.7 mg)經(jīng)半制備高效液相色譜進行分離，獲得化合物7(1.9 mg)。

2 結(jié)構(gòu)鑒定

由13C NMR、DEPT譜及高分辨質(zhì)譜m/z536.503 9[M+H]+，(calcd for C34H66NO3,536.503 7，m/z558.486 0[M+Na]+，(calcd for C34H65NO3Na，558.486 2)可以確定其分子是為C34H65NO3(不飽和度為3)。1H NMR譜中δH6.26(1H，brs，H-N)處有酰胺的N-H的特征吸收峰，在低場區(qū)存在4個烯質(zhì)子信號：δH5.78(1H，dt，J=15.5，6.6 Hz，H-4′)，5.56(1H，dt，J=15.5，6.6 Hz，H-3′)，5.41(1H，dt，J=15.5，6.6 Hz，H-7′)，5.38(1H，dt，J=15.5，6.6 Hz，H-6′)；三個連氧質(zhì)子信號：δH4.32 (1H，m，H-2′)，3.95(1H，dd，J=11.3，3.6 Hz，Ha-1′′)，3.69(1H，dd，J=11.3，3.6 Hz， Hb-1′′)；一個連氮質(zhì)子：3.90(1H， m， H-1′)；在高場區(qū)有5個亞甲基質(zhì)子信號：δH2.23 (2H，t，J=7.7 Hz，H-2)，2.13(2H，q，J=7.2，6.7 Hz，H-6)，2.07(2H，q，J=7.2， 6.7 Hz，H-7)，1.96(2H，q，J=7.0，Hz，H-10)，1.63(2H，m，H-3)；19個無支鏈脂肪鏈質(zhì)子信號：δH1.34-1.24 (38H， m， H-4， 5， 8， 9， 11～15， 5′， 8′～16′)；以及兩個端甲基質(zhì)子信號：0.87 (6H， t，J=6.6 Hz， H-17′及H-16)，這表明了此化合物有可能為神經(jīng)酰胺類化合物。根據(jù)1H NMR、13C NMR和DEPT及HSQC譜對化合物1的C、H分別進行相應(yīng)的歸屬(見表1)，低場區(qū)δC174.1 (C-1)表明是一個酰胺基，同時給出4個烯碳信號：δC133.7 (C-4′)， 131.5 (C-3′)， 129.3 (C-7′)， 129.1 (C-6′)，2個連氧碳信號：δC74.8 (C-2′)， 62.6 (C-1′′)，以及1個連氮碳信號：δC54.56 (C-1′)。以上信號提示化合物1與N-(1-羥甲基-2-羥基)4， 8-二烯-十七烷基-十六脂肪酸酰胺結(jié)構(gòu)非常相近[11]。仔細(xì)比較其NMR數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)化合物1的C-6′， 7′的化學(xué)位移130.6 (C-7′)， 130.4 (C-6′)向低場移，表明雙鍵位置在C-6′， 7′位。這一推論也被觀測到的H-3′/C-2′，C-4′，H-4′/C-2′，C-6′，H-5′/C-4′，C-6′，H-7′/C-6′，H-8′/C-6′的HMBC相關(guān)所證實。1H-1H COSY圖譜的信號可以進一步證實分別存在-CH2-(CH2)13-CH3及-CH-(CH)4-CH2-(CH)2-(CH2)9-CH3兩個結(jié)構(gòu)片段單獨的自旋系統(tǒng)。在NOE圖譜中，H-3′分別H-2′， 1′， 5′有相關(guān)信號，H-7′與H-5′，9′有相關(guān)信號說明C-3′， 4′，C-6′， 7′構(gòu)成的雙鍵均為反式的，同時H-2和H-1′′的NOESY有相關(guān)，表示它們位于同側(cè)，說明1′-CH2OH和2′-OH為R構(gòu)型。在上述分析的基礎(chǔ)上，確定化合物1的結(jié)構(gòu)為N-(1-羥甲基-2-羥基) 3， 6-二烯-十七烷基-十六脂肪酸酰胺(N-[(1-hydroxymethyl)-2-hydroxy-3，6-heptadecadienyl]-hexadecanamide)。化合物1的核磁數(shù)據(jù)及相關(guān)詳細(xì)結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)原始圖譜可從本刊官網(wǎng)免費下載(www.trcw.ac.cn)。

圖1 化合物1～7的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of compounds 1-7

圖2 化合物1的1H-1H COSY、NOESY及HMBC主要相關(guān)信號Fig.2 Key correlations of 1H-1H COSY、NOESY and HMBC for Compound 1

表1 化合物1的1H、13C譜及1H-1H COSY和HMBC的主要相關(guān)信號Table 1 1H,13C NMR data and key 1H-1H COSY,HMBC correlations of 1

化合物2黃色粉末,溶于甲醇;C14H18O4， ESI-MS:m/z251 [M+H]+；1H NMR (600 MHz，MeOD)δH：7.73 (2H， dd，J=6.0，3.6 Hz，H-3，6)，7.62(2H，dd，J=6.0， 3.6 Hz，H-4，5)，4.07(2H，t，J=6.6 Hz，H-1′，1′′)，2.01(2H，m，H-2′，2′′)，0.99(6H， t，J=6.6 Hz，H-3′，3′′)；13C NMR(150 MHz，MeOD)δC：166.8(CO)，131.9(C-1，2)， 130.4(C-4，5)，129.3(C-3，6)，64.9(C-1′，1′′)，31.3(C-2′，2′′)，19.3(C-3′，3′′)?；衔?核磁數(shù)據(jù)與文獻[12]所報道的鄰苯二甲酸二丙酯的核磁數(shù)據(jù)基本一致，因此該化合物被鑒定為鄰苯二甲酸二丙酯(Dipropyl phthalate)

化合物3無色結(jié)晶,溶于甲醇;C14H14O，ESI-MS:m/z199 [M+H]+；1H NMR(600 MHz，MeOD)δH：7.45(2H，m，H-3′′，5′′)，7.40(2H，m，H-2′′，6′′)，7.34 (1H， d，J= 7.8 Hz，H-4′′)，7.28(1H，t，J= 1.8 Hz，H-5)，7.27(1H，t，J= 2.4 Hz，H-6)，7.16(2H，m，H-2，4)，3.16(4H，m，H-1′，2′)；13C NMR(150 MHz，MeOD)δC：156.8(C-1)，143.9 (C-3)，143.1(C-1′′)，136.6(C-5)，133.6(C-3′′，5′′)，131.0(C-2′′，6′′)，129.4(C-4′′)，128.9(C-4)，127.0(C-2)，121.5(C-6)，40.7(C-1′)，33.3(C-2′)?；衔?核磁數(shù)據(jù)與文獻[13]所報道的3-(2-苯乙基)苯酚的核磁數(shù)據(jù)基本一致，因此該化合物被鑒定為3-(2-苯乙基)苯酚(3-(2-phenylethyl) Phenol)。

化合物4無色結(jié)晶,溶于甲醇;C9H10O3， ESI-MS:m/z166 [M]+；1H NMR(600 MHz，MeOD)δH：7.07(2H，d，J=8.4 Hz，H-2，6)，6.71(2H，m，H-3，5)，3.66(3H，s，4-OCH3)， 3.53(3H，s，OCH3)；13C NMR(150 MHz，MeOD)δC：173.3(CO)，156.3(C-4)，130.0(C-2，6)，125.0(C-1)，115.0(C-3，5)，55.2(4-OCH3)，51.1(OCH3)?；衔?核磁數(shù)據(jù)與文獻[14]所報道的對甲氧基苯甲酸甲酯的核磁數(shù)據(jù)基本一致，因此該化合物被鑒定為對甲氧基苯甲酸甲酯 (Methyl ester ofp-methoxybenzoicacid)。

化合物5黃色粉末,溶于氯仿;分子式 C20H30O4，ESI-MS:m/z335 [M+H]+；1H NMR (600 MHz，CDCl3)δH：8.19(2H，dd，J=5.6，3.6Hz，H-3，6)，7.71(2H，dd，J=5.6， 3.6Hz， H-4，5)，4.22(4H，m，H-1′，1′′)，1.68(4H，m，H-2′，2′′)，1.31(8H，m，H-3′，4′，3′′，4′)，1.25(10H，m，H-5′，5′′)，0.91(6H，m，H-6′，6′′)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δC：167.1(CO)，133.5(C-4，5)，131.6(C-1，2)，127.5(C-3，6)，65.4(C-1′，1′′)，32.6(C-2′，2′′)，31.2(C-4′，4′′)，29.7(C-3′，3′′)，24.5(C-5′，5′′)，15.0(C-6′，6′′)?；衔?核磁數(shù)據(jù)與文獻[15]所報道的鄰苯二甲酸二己酯基本一致，因此該化合物被鑒定為鄰苯二甲酸二己酯(Dihexyl phthalate)。

化合物6淡黃色粉末,溶于DMSO;分子式C14H20O8，ESI-MS:m/z317.22 [M+H]+;1H NMR(600 MHz，DMSO)δH：7.03(2H，J=9.0 Hz，H-3，5)，6.96(2H，d，J=9.0 Hz， H-2，6)，4.17(1H，d，J=7.6 Hz，H-1′′)，4.06(1H，s，H-5′′)，3.90-3.78(2H，m，H-2′′， 3′′)，3.61-3.45(4H，m，H-4′′，5′′，6′′)，3.05(2H，m，H-2′)，1.90(2H，m，H-1′);13C NMR(150 MHz，DMSO)δC：185.5(C-1)，153.5(C-3，5)，126.5(C-2，6)，102.9(C-1′′)，76.9(C-5′′)，76.8(C-2′′)，73.5(C-4′′)，70.1(C-4)，67.5(C-2′)，64.0 (C-6′′)，42.2(C-1′)?；衔?核磁數(shù)據(jù)與文獻[16]所報道的梾木甙的核磁數(shù)據(jù)基本一致，因此該化合物被鑒定為梾木甙(Cornoside)

化合物7白色粉末,溶于DMSO;分子式C10H12N4O5，ESI-MS:m/z269 M+H]+；1H NMR (600 MHz，DMSO)δH：8.29(1H，s，H-2)，8.04(1H，s，H-8)，5.85(1H，d，J=6.0， H-1′)，5.25(1H，m，3′-OH)，4.49(1H，s，H-2′)，4.11(1H，m，H-3′)，3.94(1H，m， H-4′)，3.65(1H，m，H-5′)；13C NMR(150 MHz，DMSO)δC：156.3(C-6)，148.3(C-4)， 146.9(C-8)，138.7(C-2)，124.5(C-5)，87.6(C-1′)，85.8(C-4′)，74.1(C-2′)，70.4(C-3′)，61.4(C-5′)?；衔?核磁數(shù)據(jù)與文獻[17]所報道的肌苷的核磁數(shù)據(jù)基本一致，因此該化合物被鑒定為次黃嘌呤核苷(Inosine)。

3 抗污損生物附著活性研究

通過測試兩種柳珊瑚中的化學(xué)成分1～7抗藤壺幼蟲附著活性發(fā)現(xiàn)，除化合物3，7外均表現(xiàn)潛在的抗海洋污損生物藤壺幼蟲附著活性，其EC50值均低于25 μg/mL(美國海軍研究中心認(rèn)定能做海洋抗污損劑最低標(biāo)準(zhǔn))，且LC50(半數(shù)致死濃度)也均高于 100 μg/mL (表2)。

表2化合物1～7的抗藤壺幼蟲附著活性
Table 2 Anti-larval settlement activity of compounds1-7againstB.amphitrite

化合物CompoundEC50(μg/mL)LC50(μg/mL)18.72±0.72>100212.34±0.75>1003NAND415.33±0.83>100518.74±1.14>20066.89±1.22>1007NA>100

注：NA表示其EC50大于25 μg mL-1，無抗污損活性，ND表示由于化合物質(zhì)量太少或溶解度太小無法測試。
Note:NA indicated the EC50is more than 25 μg mL-1,no anti fouling activity,ND indicated the compound quality or solubility is too low to carry out the experiment.

4 結(jié)論

通過現(xiàn)代各種分離鑒定方法，從北部灣兩種柳珊瑚Anthogorgiacaerulea和Menellakanisa提取物中共分離鑒定了7個化合物，并采用典型海洋污損生物藤壺的幼蟲篩選模型，測試了化合物1～7的抗海洋污損生物附著能力，發(fā)現(xiàn)除化合物3，7外均顯示出具有開發(fā)成海洋抗污劑的潛力(EC50< 25 μg /mL)，其中以化合物6的活性最好，新化合物1的活性次之，其抗藤壺幼蟲附著EC50分別為6.89，8.72 μg/mL。