當歸MYB4轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆及表達分析

， ，彩霞，， ，*

(1.甘肅中醫(yī)藥大學 藥學院，甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅中醫(yī)藥大學 科研實驗中心，甘肅 蘭州 730000)

當歸(Angelicasinensis)是傘形科多年生草本植物，其干燥根是我國傳統(tǒng)的大宗藥材之一，具有補血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便等功效[1]，藥用歷史悠久，在方劑中的應(yīng)用甚廣[2]。阿魏酸是當歸的主要藥效成分之一，具有抗血小板聚集、增強前列腺素活性、鎮(zhèn)痛、緩解血管痙攣等作用，是治療心腦血管疾病藥品的基本原料[3]。阿魏酸能清除自由基，增強谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性，抑制酪氨酸酶促反應(yīng)，調(diào)節(jié)人體免疫機能，在醫(yī)療保健、美容護膚、食品等行業(yè)用途廣泛[4-6]。阿魏酸是苯丙烷代謝的中間產(chǎn)物，其生物合成途徑由苯丙烷代謝最初的苯丙氨酸解氨酶開始，經(jīng)過一系列酶促催化反應(yīng)生成阿魏酸及其衍生物[7]。阿魏酸作為當歸的代謝產(chǎn)物，在植物中的合成可能受誘發(fā)因子作用下的信號轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)錄因子活性、結(jié)構(gòu)基因調(diào)控等多個因素影響[8]。

轉(zhuǎn)錄因子是一類能與真核基因啟動子中順式作用元件發(fā)生相互作用的DNA結(jié)合蛋白，從而激活或抑制特定代謝途徑中多個基因的協(xié)調(diào)表達，進而啟動次生代謝途徑[9]。轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)由4個功能區(qū)組成，根據(jù)高度保守的DNA結(jié)合域進行分類，其中MYB轉(zhuǎn)錄因子以含有1～3個串聯(lián)且不完全重復(fù)的DNA結(jié)構(gòu)域為共同特征，是數(shù)量最多且功能最廣泛的一類轉(zhuǎn)錄因子[10]。轉(zhuǎn)錄因子中提高目的基因表達量的一類稱為激活型轉(zhuǎn)錄因子，而少數(shù)降低目的基因表達量的一類則稱為抑制型轉(zhuǎn)錄因子[11]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)MYB4參與苯丙烷代謝途徑，下調(diào)相關(guān)代謝支路中多個酶基因的表達，是一類起負調(diào)控作用的抑制型轉(zhuǎn)錄因子[12]。阿魏酸的合成與苯丙烷代謝具有共同的路徑，因此推測MYB4轉(zhuǎn)錄因子可能參與阿魏酸的生物合成過程。

迄今為止，對當歸中阿魏酸的生物合成研究還僅限于關(guān)鍵酶基因的克隆和分析，而基于當歸中阿魏酸生物合成轉(zhuǎn)錄因子的克隆和表達的研究還未見報道。本研究采用同源克隆聯(lián)合RACE的方法克隆當歸MYB4基因(AsMYB4)的cDNA全長序列，并對其序列結(jié)構(gòu)特征、系統(tǒng)聚類做初步分析，預(yù)測其生物學功能。利用qRT-PCR分析該基因的組織表達特異性，構(gòu)建當歸MYB4基因的大腸桿菌表達菌株，并進行目的蛋白的表達分析，為進一步探索MYB蛋白結(jié)構(gòu)和功能提供重要工具，為闡明阿魏酸生物合成的分子機制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 供試當歸植株于2017年8月采自甘肅岷縣。

1.1.2 菌株與質(zhì)粒 克隆菌株大腸桿菌(E.coli)DH5α、表達菌株E.coliBL21(DE3)均由甘肅中醫(yī)藥大學科研實驗中心實驗室保存；克隆載體pMD19-T質(zhì)粒購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司，表達載體pGEX-4T-3質(zhì)粒購自Promega公司(美國)。

1.1.3 酶與試劑 GoTaq?Real-Time PCR Systems試劑盒購于Promega公司(美國)；SMARTerTMRACE cDNA Amplication Kit、Prime Script RT reagent Kit、In-Fusion?HD Cloning Kit購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)、氨芐青霉素、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自Solarbio公司(北京)；氯霉素購自青島生工生物科技有限公司；質(zhì)粒DNA小提試劑盒、DNA膠回收與純化試劑盒購自北京全式金有限公司。

1.1.4 儀器與設(shè)備 儀器與設(shè)備包括PCR儀(Bio-Rad icycler IQ，美國)、qRT-PCR儀(楓嶺FTC-3000P，加拿大)、超微量分光光度計(Thermo BioMate 3S，美國)、B2級生物安全柜(HFsafe-1200 B2，上海)、電泳系統(tǒng)(DYY-5，北京)、氣浴恒溫搖床(GFL3033，德國)、全波長酶標儀(Bio-Rad Bench mark plus，美國)、多功能成像系統(tǒng)(Azure Biosystems Inc C300，美國)、低溫高速離心機(Biofuge fresco ZY-064-1，美國)等。

1.2 試驗方法

1.2.1 當歸總RNA提取及cDNA的合成 根據(jù)溫隨超等[13]的CTAB法提取總RNA，-75 ℃保存?zhèn)溆?。采用PrimeScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA的第1鏈，-20 ℃保存?zhèn)溆?。利?0 g/L瓊脂糖電泳檢測RNA的完整性，以分光光度計法測定RNA濃度及純度。

1.2.2 當歸MYB4基因的保守區(qū)克隆 根據(jù)同源比對獲得MYB4基因的保守區(qū)，設(shè)計簡并引物MYB4-F、MYB4-R(表1)，以cDNA為模板擴增MYB4基因核心片段，依據(jù)PremixTaq說明書建立PCR反應(yīng)體系：2×PremixTaq10 μL、cDNA 1 μL、正反向引物各0.5 μL、ddH2O 8 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，32個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后切膠回收，并連接至pMD19-T載體上，熱擊法轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細胞，在抗性平板上隨機挑取陽性單克隆，經(jīng)PCR驗證后測序分析。

表1 基因克隆、表達分析和載體構(gòu)建所需引物序列

1.2.3 當歸MYB4基因cDNA末端擴增 使用SMARTerTMRACE cDNA Amplication Kit合成3′-RACE和5′-RACE cDNA。根據(jù)測序獲得的MYB4保守區(qū)序列，設(shè)計3′端、5′端克隆的特異引物3′GSP1、3′GSP2、5′GSP(表1)，進行RACE擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后進行TA克隆。

1.2.4 當歸MYB4基因全長擴增 將測序正確的MYB4末端序列和核心片段進行拼接，獲得當歸MYB4基因cDNA全長序列，由編碼區(qū)序列設(shè)計全長擴增引物MYB4-S和MYB4-A(表1)。以5′-RACE cDNA為模板進行PCR擴增，除退火溫度為56 ℃外，反應(yīng)體系及反應(yīng)程序同1.2.2。PCR產(chǎn)物經(jīng)檢測后進行TA克隆，分析測序結(jié)果與理論全長序列的一致性。

1.2.5 生物信息學分析 以NCBI的ORF Finder尋找當歸MYB4基因的開放閱讀框；采用NCBI的Blast功能執(zhí)行核苷酸及氨基酸序列的同源搜索，利用DNAMAN軟件對同源物種的氨基酸序列進行多重比對，以MEGA 5.0軟件中的鄰位歸并法做聚類分析并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。分別運用ExPASy在線服務(wù)器的ProtParam、ProtScale分析該基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)；采用SignalP 4.1 Serve(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)進行信號肽預(yù)測；使用TMHMM server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)預(yù)測蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)特征；借助Psort(http://psort. hgc. jp/form. Html)進行亞細胞定位預(yù)測分布區(qū)域；應(yīng)用ScanProsite(https://prosite.expasy.org/)分析氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域；采用PBIL(https://prabi.ibcp.fr/htm/site/web/login)分析當歸MYB4基因編碼蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)；利用SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)建立蛋白質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)模型。

1.2.6 當歸MYB4基因表達分析 以當歸GAPDH基因為內(nèi)參基因，設(shè)計引物GAPDH-qF、GAPDH-qR(表1)，由當歸MYB4基因的特異性序列設(shè)計定量PCR引物MYB4-qF、MYB4-qR(表1)，以當歸葉片、葉柄、根部的cDNA為模板，參照GoTaq?Real-Time PCR Systems試劑盒說明書，進行實時熒光定量PCR分析。反應(yīng)體系：2×qPCR Master Mix 10 μL、cDNA 1 μL、上下游引物各0.8 μL、無RNase水7.4 μL。擴增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s,40個循環(huán)。每個組織樣品設(shè)置3個平行，利用2-ΔΔCt方法進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.7 原核表達載體的構(gòu)建 根據(jù)當歸MYB4基因的ORF序列設(shè)計含EcoRⅠ酶切位點的特異引物MYB4-tF和MYB4-tR(表1)，以測序后全長序列正確的質(zhì)粒為模板，除退火溫度為58 ℃外，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同1.2.2。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定后，切膠回收目的DNA。

提取pGEX-4T-3載體質(zhì)粒，用EcoRⅠ單酶切，回收載體。采取In-Fusion?HD Cloning Kit構(gòu)建目的片段與載體的重組質(zhì)粒，采用熱擊法將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞中，篩選陽性單菌落，經(jīng)PCR驗證后進行測序分析。確定目的序列與載體組裝無誤后，將重組后的載體命名為pGEX-4T-3-AsMYB4。

1.2.8 當歸MYB4基因的原核表達 將含pGEX-4T-3-AsMYB4質(zhì)粒的陽性克隆接種于10 mL LB液體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素、氯霉素)中，振蕩培養(yǎng)過夜。次日進行亞培養(yǎng)至A600約為0.6時，吸取2 mL菌液作為0 h的非誘導樣品，在剩余菌液中加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，23 ℃、160 r/min誘導6 h。取2 mL菌液，低溫離心收集菌體，加少量1×PBS緩沖液(含溶菌酶、蛋白酶抑制劑)混勻，加入適量4×SDS上樣緩沖液，沸水煮5 min，冷卻后利用10% SDS-PAGE檢測。同時，以含空載體質(zhì)粒菌作為對照。

1.2.9 重組蛋白表達鑒定 誘導結(jié)束后，4 ℃、5 000 r/min離心15 min，收集菌體。加入適量的1×PBS緩沖液重懸菌體，于冰浴中超聲破碎菌體至破碎完全，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，吸取上清并保留菌體沉淀，分別進行10% SDS-PAGE檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 當歸總RNA質(zhì)量分析

從當歸不同組織提取的總RNA的A260/A280為1.9～2.0，表明RNA質(zhì)量較好。RNA電泳檢測結(jié)果顯示，樣品RNA的28S rRNA信號強于18S rRNA，證明RNA完整性好，無降解(圖1)。

M：DNA分子質(zhì)量標準；1—2：根RNA；

2.2 當歸MYB4基因全長cDNA的克隆

MYB4基因保守區(qū)擴增得到1個長291 bp的DNA片段；5′端擴增得到1個長486 bp的片段，與核心片段部分重疊，并含有起始密碼子；3′端擴增得到1個長927 bp的帶有多聚A尾巴的片段，且與保守區(qū)部分重疊；全長擴增獲得1條約1 000 bp的特異條帶。上述測序結(jié)果均與預(yù)測結(jié)果一致(圖2)。

A：AsMYB4基因保守區(qū),M為DNA分子質(zhì)量標準，1—2為AsMYB4基因保守區(qū)PCR產(chǎn)物；B：RACE產(chǎn)物,M為DNA分子質(zhì)量標準，1為5′-RACE產(chǎn)物，2為3′-RACE產(chǎn)物；C：AsMYB4基因全長,M為DNA分子質(zhì)量標準，1—2為AsMYB4基因全長PCR產(chǎn)物

根據(jù)測序結(jié)果，得到1條長為1 189 bp的當歸MYB4基因cDNA全長序列，ORF包含804個核苷酸，編碼的多肽鏈由267個氨基酸構(gòu)成，3′、5′非翻譯區(qū)分別為207、178 bp，ATG、TAA分別位于起始密碼子、終止密碼子處(圖3)。Blast比對分析結(jié)果顯示，當歸MYB4與胡蘿卜MYB308的一致性達到93%，與檸條錦雞兒MYB4、中國辣椒MYB4、陸地棉MYB308、黃瓜MYB308等氨基酸序列同源性達到74%以上。本研究結(jié)果進一步證實，獲得的序列是源于當歸MYB4基因的全長cDNA，命名為AsMYB4(GenBank登錄號：MG736315)。上述與當歸MYB4一致性較高的MYB轉(zhuǎn)錄因子，大多與苯丙烷代謝相關(guān)[10-12]，推測當歸MYB4參與苯丙烷代謝調(diào)控。

下劃線處表示起始密碼子，方框內(nèi)表示終止密碼子

2.3 AsMYB4基因的生物信息學分析

2.3.1 AsMYB4蛋白的理化性質(zhì) AsMYB4蛋白的預(yù)測分子質(zhì)量為30 ku，分子式為C1 280H2 046N390O404S19，理論等電點為8.45，負電荷殘基總數(shù)(Asp+Glu)為33，正電荷殘基總數(shù)(Arg+Lys)為37，不穩(wěn)定系數(shù)為48.41，屬于不穩(wěn)定蛋白；親水性得分為-0.743，為親水蛋白(圖4)。

圖4 AsMYB4蛋白親水/疏水性預(yù)測

2.3.2 AsMYB4蛋白的結(jié)構(gòu)特征 保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示，AsMYB4氨基酸序列的N端構(gòu)成了R2、R3 兩個典型的MYB-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，由2個HTH結(jié)構(gòu)形成，為MYB蛋白的典型結(jié)構(gòu)特征。如圖5所示，AsMYB4氨基酸序列的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域分別有3、2個具有高度保守性的色氨酸，間隔18～19個氨基酸均勻排列，且存在MYB蛋白N端的特征序列(MGR[A/T]PCC[E/D]K[V/I]G)[14]。在AsMYB4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域中，存在1個和bHLH轉(zhuǎn)錄因子相互作用的結(jié)構(gòu)域([D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R)[15]，推測AsMYB4可能與其他bHLH型轉(zhuǎn)錄因子形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，共同調(diào)節(jié)靶基因的表達。

AsMYB4蛋白二級結(jié)構(gòu)主要由30.34%的α螺旋、46.07%的隨機卷曲、少量的延伸鏈、β轉(zhuǎn)角組成(圖6)。三維建模結(jié)果顯示，AsMYB4蛋白與胡蘿卜MYB308蛋白的空間結(jié)構(gòu)相近，即在DNA結(jié)合域構(gòu)成2個螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(helix-turn-helix，HTH)結(jié)構(gòu)，在空間上形成2個環(huán)狀的溝槽，符合R2R3-MYB蛋白的構(gòu)型(圖7)。

2.3.3 AsMYB4蛋白的功能預(yù)測 AsMYB4的氨基酸序列中沒有跨膜結(jié)構(gòu)或者膜結(jié)合區(qū)域，可能是膜外蛋白。AsMYB4蛋白不具有信號肽，說明AsMYB4蛋白不是一個分泌蛋白。AsMYB4蛋白存在于核內(nèi)的可能性最大，究其原因可能是轉(zhuǎn)錄因子蛋白運輸?shù)郊毎耍c靶基因的順式作用元件結(jié)合才能調(diào)控基因的表達[16]。因此，亞細胞定位的預(yù)測進一步證明AsMYB4是一個MYB類轉(zhuǎn)錄因子。

方框中為R2R3-MYB的N端特征序列，圓圈中為與bHLH蛋白相互作用的特征序列

h：α螺旋；c：隨機卷曲；e：延伸鏈；t：β轉(zhuǎn)角

A：當歸MYB4蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型；

2.3.4 AsMYB4蛋白的同源比對及系統(tǒng)進化樹分析 同源比對分析結(jié)果表明，AsMYB4氨基酸序列在N端存在保守的2個DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，且與其他MYB轉(zhuǎn)錄因子的同源區(qū)都集中在這一區(qū)域。C端同源性極低，對C端進行搜索發(fā)現(xiàn)，AsMYB4的C端有2個與轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)的保守基序C1(PDLNL[D/E]LxI[G/S])、C2(RGIDPxTHRP[L/I]NE)，這與其他MYB類轉(zhuǎn)錄抑制因子的結(jié)構(gòu)特征一致[17](圖8)。

系統(tǒng)進化樹分析表明，AsMYB4與胡蘿卜MYB308聚為一類，與黃瓜MYB308、大豆MYBZ2、麻風樹MYB308、檸條錦雞兒MYB4的親緣關(guān)系較近，與石榴MYB1、葡萄MYB4、野茶樹MYB4等也聚為一類，但親緣關(guān)系相對較遠(圖9)。研究表明，上述MYB蛋白在調(diào)節(jié)苯丙烷類代謝過程中起負調(diào)控作用[18-19]。由于在該系統(tǒng)樹上，功能相關(guān)的MYB大都聚到一起，結(jié)合前面的結(jié)構(gòu)和功能域的分析，推測AsMYB4屬于R2R3類MYB蛋白的第4亞家族[12]，作為轉(zhuǎn)錄抑制因子下調(diào)苯丙烷代謝途徑中相關(guān)酶基因的表達。

方框中由上至下為2個DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，圓圈中由上至下分別為C1、C2轉(zhuǎn)錄抑制保守基序

2.4 AsMYB4基因組織特異性表達分析

利用qRT-PCR檢測AsMYB4的表達量，結(jié)果表明，AsMYB4基因在當歸不同組織中的表達量不同，且差異達到顯著水平，葉片中表達量最高，分別是葉柄、根的1.1、2.0倍(圖10)。

2.5 AsMYB4基因原核表達菌株的鑒定

隨機挑取6個單菌落，用目的基因引物進行PCR驗證，電泳檢測結(jié)果顯示，特異條帶大小均接近804 bp(圖11)，表明AsMYB4片段已插入表達載體中。菌樣測序結(jié)果與AsMYB4基因的編碼區(qū)序列完全一致，表明原核表達菌株構(gòu)建成功。

2.6 AsMYB4蛋白原核表達分析

經(jīng)10% SDS-PAGE電泳檢測，與含空載體質(zhì)粒菌及未誘導的重組菌相比，IPTG誘導的重組菌在56 ku處出現(xiàn)特異條帶，其中包含大小為26 ku的GST標簽蛋白，則AsMYB4蛋白大小約為30 ku(圖12)。檢測結(jié)果與預(yù)期一致，初步認為獲得了目的蛋白。AsMYB4蛋白在上清液中幾乎沒有，主要存在于沉淀中，即目的蛋白以胞內(nèi)不溶性狀態(tài)存在，可能是目的蛋白表達后未能正常折疊，不能形成有活性的成熟蛋白[20]，后續(xù)將對培養(yǎng)條件進行優(yōu)化。

圖中數(shù)字表示Bootstrap驗證中基于1 000次重復(fù)該節(jié)點可信度

*表示0.05水平顯著性差異

M：DNA分子質(zhì)量標準；1—6：pGEX-4T-3-AsMYB4菌落PCR

M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1、4：pGEX-4T-3空載菌未誘導和誘導6 h全細胞裂解液；2—3：pGEX-4T-3-AsMYB4重組菌未誘導上清和沉淀；5—6：pGEX-4T-3-AsMYB4重組菌誘導6 h的上清和沉淀

圖12AsMYB4蛋白原核表達分析

3 結(jié)論與討論

轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄水平上往往是多途徑、多基因協(xié)同調(diào)控，在植物次生代謝研究方面具有重要作用。本研究利用同源克隆結(jié)合RACE的方法，從當歸中克隆出1個AsMYB4基因，其cDNA序列全長1 189 bp，包含804 bp的ORF，編碼267個氨基酸，3′、5′UTR分別為207、178 bp，為典型的R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子家族成員。氨基酸比對結(jié)果顯示，AsMYB4與胡蘿卜MYB308的同源性最高，達到93%。AsMYB4氨基酸序列的N端存在保守的R2、R3 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和1個與bHLH轉(zhuǎn)錄因子相互作用的結(jié)構(gòu)域。C端同源性低，存在2段與抑制型MYB蛋白相同的保守基序。系統(tǒng)進化分析表明，AsMYB4與傘形科植物胡蘿卜MYB308的親緣關(guān)系最近，同屬于第4亞族抑制型轉(zhuǎn)錄因子。AsMYB4基因在根部的表達量最低，這一點與當歸中的藥效成分阿魏酸主要是在根部合成一致，進一步證明了AsMYB4是一個R2R3-MYB負調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，可能在阿魏酸生物合成中起轉(zhuǎn)錄抑制作用。

獲得純化的轉(zhuǎn)錄因子蛋白，最有效的方法就是通過原核表達系統(tǒng)在大腸桿菌中大量表達目的重組蛋白[21]。本研究成功構(gòu)建當歸MYB4基因的大腸桿菌表達菌株，經(jīng)IPTG誘導目的蛋白大量表達，后續(xù)將通過優(yōu)化表達條件獲得有活性的AsMYB4蛋白，用于體外凝膠遷移以鑒定蛋白質(zhì)與元件的作用情況，為深入研究AsMYB4基因在阿魏酸合成調(diào)控中的功能奠定基礎(chǔ)。