銅綠假單胞菌F190—342-I21—83基因的克隆及其融合蛋白的原核表達(dá)

張明亮，閆新武，孫長(zhǎng)江，顧敬敏，崔子寅，韓文瑜*

(1.河南省動(dòng)物疫病防控與營(yíng)養(yǎng)免疫院士工作站，河南 安陽(yáng) 455000； 2.吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130062； 3.安陽(yáng)工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，河南 安陽(yáng)455000； 4.河南省孟津縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南 孟津 471100)

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)屬革蘭氏陰性桿菌，能夠引起以鼻孔及嘴角流血為主要特征的水貂出血性肺炎，造成發(fā)病水貂突然死亡。自1953年首次確認(rèn)銅綠假單胞菌是水貂出血性肺炎的病原以來(lái)，該病在全球迅速擴(kuò)散，給水貂養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的損失[1]。長(zhǎng)期以來(lái)，抗生素是防治水貂出血性肺炎的有效武器。然而，隨著抗生素的濫用，銅綠假單胞菌的耐藥性呈現(xiàn)日漸升高的趨勢(shì)，常規(guī)抗生素對(duì)其防治效果越來(lái)越差。因此，亟須開發(fā)新的防治手段。

F基因和I基因分別編碼銅綠假單胞菌的2種外膜蛋白。研究表明，銅綠假單胞菌的外膜蛋白F在銅綠假單胞菌黏附真核細(xì)胞的過(guò)程中起著重要的作用，參與了諸多侵染過(guò)程[2]。銅綠假單胞菌擁有眾多血清型，但外膜蛋白F高度保守的特性突出。外膜蛋白F作為銅綠假單胞菌重要的孔蛋白，在前期的研究中展現(xiàn)出了良好的免疫原性，能夠使動(dòng)物和人類免受多種血清型銅綠假單胞菌的感染，已被證實(shí)是應(yīng)對(duì)銅綠假單胞菌的重要保護(hù)性抗原[3]。此外，外膜蛋白I作為重要的保守抗原，也能誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生高滴度的抗體，在清除感染動(dòng)物體內(nèi)銅綠假單胞菌方面顯示出很大的優(yōu)勢(shì)[4]。F190—342-I21—83是F蛋白和I蛋白重要肽表位的融合體[5]，在小鼠感染模型、燒傷模型等研究中凸顯出產(chǎn)生保護(hù)性抗體的優(yōu)越性[6]。但在銅綠假單胞菌引發(fā)的水貂出血性肺炎的病原檢測(cè)方面以及保護(hù)性生物制品的開發(fā)方面，關(guān)于F蛋白和I蛋白的應(yīng)用尚屬空白。因此，本研究在臨床分離的水貂源銅綠假單胞菌ZHDL9菌株基因組的基礎(chǔ)上，克隆出銅綠假單胞菌外膜蛋白F和I的表位基因F190—342(F1)和I21—83(I2)，將其無(wú)縫融合后，構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-28a-F1I2，在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白F1I2，旨在為防治水貂出血性肺炎生物制品的研究與開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及血清

水貂源銅綠假單胞菌ZHDL9菌株、大腸桿菌克隆菌株DH5α、表達(dá)菌株BL21(DE3)、表達(dá)質(zhì)粒pET-28a及ZHDL9菌株水貂陽(yáng)性血清(效價(jià)1∶2 000)均來(lái)自于河南省動(dòng)物疫病防控與營(yíng)養(yǎng)免疫院士工作站。

1.2 主要試劑

銅綠假單胞菌選擇性分離培養(yǎng)基(溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基)購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；ExTaqDNA polymerase、T4 DNA 連接酶、DL15000 DNA Marker及DL2000 DNA Marker均購(gòu)自Takara公司；限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Promega公司；質(zhì)粒及細(xì)菌基因組提取試劑盒均購(gòu)自O(shè)mega公司；TAB顯色液購(gòu)自福建邁新生物科技有限公司；HRP標(biāo)記的兔抗水貂IgG購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；His標(biāo)簽蛋白純化鎳柱購(gòu)自Thermo公司；標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker購(gòu)自NEB公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

參照GenBank公布的OprF序列(JX040481.1)與OprI序列(X58714.1)分別設(shè)計(jì)含有EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)的引物PF1/PF2與PI1/PI2，引物合成由北京六合華大基因科技股份有限公司完成(表1)。

表1 銅綠假單胞菌F1和I2基因的PCR擴(kuò)增引物序列

注：下劃線部分為限制性酶切位點(diǎn)。

1.4 銅綠假單胞菌基因組及質(zhì)粒提取

參照Omega公司基因組提取試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書獲得銅綠假單胞菌ZHDL9菌株基因組及質(zhì)粒提取產(chǎn)物。

1.5 銅綠假單胞菌F1I2融合基因的獲取

以獲得的ZHDL9菌株基因組為模板，采用引物PF1/PF2擴(kuò)增F1基因片段，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。以獲得的ZHDL9菌株基因組為模板，采用引物PI1/PI2擴(kuò)增I2基因片段，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

將上述所得F1和I2基因進(jìn)行融合，共分2步進(jìn)行。第1步反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 2 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，10個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。第2步反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 2 min；94 ℃ 40 s，62 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

將最終獲得的F1I2融合基因克隆至pMD18-T質(zhì)粒中，陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為pMD18-T-F1I2，送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.6 重組表達(dá)菌株BL21(pET-28a-F1I2)的構(gòu)建及鑒定

將獲得的重組質(zhì)粒pMD18-T-F1I2與質(zhì)粒pET-28a同時(shí)用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和EcoR Ⅰ 進(jìn)行雙酶切，然后回收F1I2融合基因片段和pET-28a質(zhì)粒片段，并用T4 DNA連接酶連接。轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)BL21(DE3)，將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子BL21(pET-28a-F1I2)擴(kuò)大培養(yǎng)，小批量制備質(zhì)粒，用內(nèi)切酶EcoR Ⅰ 和HindⅢ消化后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)鑒定。

1.7 融合蛋白F1I2的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將重組菌株BL21(pET-28a-F1I2)和對(duì)照菌株BL21(pET-28a)分別接種至含50 μg/mL KANA的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.6時(shí)，加入1 mmol/L的IPTG，25 ℃誘導(dǎo)8 h。分別取適量菌液于1.5 mL EP管中，離心后棄上清，使用無(wú)菌PBS重懸菌體，并加入5×Loading Buffer，煮沸10 min，離心后取上清，用12% SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。電泳結(jié)束后，將蛋白膠置于染色液中，染色2 h。最后，將蛋白膠置于脫色液中脫色至條帶清晰。

將誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌BL21(pET-28a-F1I2)離心后，用無(wú)菌PBS洗滌2遍，取適量的MES Buffer重懸沉淀。將重懸菌液置于小燒杯中，并在冰浴中超聲破碎，待菌液超聲破碎至澄清時(shí)，取出菌液。6 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清。上清經(jīng)0.8 μm濾器過(guò)濾后加入準(zhǔn)備好的His標(biāo)簽蛋白純化鎳柱，進(jìn)行F1I2融合蛋白的純化。最后向純化柱中加入適量的洗脫液洗脫蛋白質(zhì)，SDS-PAGE檢測(cè)純化后的融合蛋白F1I2。

1.8 融合蛋白F1I2表達(dá)的檢測(cè)

Western Blotting檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)情況。首先將重組菌BL21(pET-28a-F1I2)和對(duì)照菌BL21(pET-28a)的純化蛋白樣品電泳后轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為7 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將其置于封閉液中，室溫封閉4 h。以ZHDL9菌株水貂陽(yáng)性血清為一抗、HRP標(biāo)記的兔抗水貂IgG為二抗，TAB避光顯色后觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 F1基因和I2基因的克隆及信息學(xué)分析

對(duì)PCR擴(kuò)增得到的F1基因(圖1A)和I2基因(圖1B)進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳后，分別得到462 bp和189 bp的條帶，與目的條帶大小相符。

M：DL2000 DNA Marker； 1、4：陰性對(duì)照； 2、3：F1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； 5、6：I2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物圖1 F1基因(A)和I2基因(B)的PCR擴(kuò)增結(jié)果

將PCR擴(kuò)增得到的F1和I2基因序列分別與NCBI上登錄的銅綠假單胞菌序列MFY72、ATCC3542、LMG1242和W15AUG19、ATCC3542、PAO1進(jìn)行比對(duì)分析，同源性分別在99.6%～100.0%和99.5%～100.0%，表明F1基因序列和I2基因序列與已報(bào)道的序列相比高度保守(圖2A和2B)。

2.2 重組表達(dá)菌株BL21(pET-28a-F1I2)的構(gòu)建及鑒定

F1基因和I2基因經(jīng)融合PCR后，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳，得到的F1I2融合基因條帶與651 bp的預(yù)測(cè)條帶大小相符，表明成功構(gòu)建了融合基因F1I2(圖3A)。將得到的融合基因F1I2連接至pMD18-T質(zhì)粒，得到重組質(zhì)粒pMD18-T-F1I2(圖3B)，經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ 和HindⅢ消化后，出現(xiàn)的條帶與651 bp的目的條帶大小一致(圖3B)。對(duì)酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒pMD18-T-F1I2進(jìn)行測(cè)序，分析結(jié)果表明，序列不存在核苷酸的缺失和插入。將測(cè)序正確的F1I2基因片段連接至pET-28a質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)BL21(DE3)，培養(yǎng)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子BL21(pET-28a-F1I2)后，小批量制備質(zhì)粒，用內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ消化，電泳后所得條帶與651 bp的目的條帶大小一致，表明成功構(gòu)建了重組表達(dá)菌株BL21(pET-28a-F1I2)(圖3C)。

圖2 F1基因序列(A)和I2基因序列(B)同源性分析

A：融合基因F1I2的PCR擴(kuò)增； B：重組質(zhì)粒pMD18-T-F1I2的雙酶切鑒定； C：重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-F1I2的雙酶切鑒定。M1：DL2000 DNA Marker； M2：DL15000 DNA Marker； 1：陰性對(duì)照； 2、3：F1I2 PCR擴(kuò)增結(jié)果；4—6：pMD18-T-F1I2酶切結(jié)果； 7—10：pET-28a-F1I2酶切結(jié)果圖3 重組原核表達(dá)菌株BL21(pET-28a-F1I2)的構(gòu)建及驗(yàn)證

2.3 融合蛋白F1I2的表達(dá)及純化

分別用IPTG誘導(dǎo)重組表達(dá)菌株BL21(pET-28a-F1I2)和對(duì)照菌BL21(pET-28a)，通過(guò)SDS-PAGE電泳，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照菌株BL21(pET-28a)相比，可在BL21(pET-28a-F1I2)中約30 ku處觀察到蛋白質(zhì)表達(dá)條帶，與預(yù)測(cè)的F1I2融合蛋白大小相符(圖4)。同時(shí)得到的融合蛋白F1I2可以被His鎳柱純化，表明其具有良好的可溶性。

M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1：空載體對(duì)照；2、3：重組菌表達(dá)； 4：純化的F1I2蛋白圖4 BL21(pET-28a-F1I2)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳分析

2.4 融合蛋白F1I2的Western Blotting分析

重組菌和對(duì)照菌經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜后，以ZHDL9陽(yáng)性血清作為一抗，HRP標(biāo)記的兔抗水貂IgG作為二抗，結(jié)果顯示，可在約30 ku處觀察到反應(yīng)條帶，表明原核表達(dá)的融合蛋白F1I2能與銅綠假單胞菌ZHDL9株感染的水貂血清發(fā)生特異性的免疫反應(yīng)，而對(duì)照菌則不能發(fā)生反應(yīng)(圖5)。

M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1：重組菌； 2：對(duì)照菌圖5 融合蛋白F1I2的Western Blotting分析

3 結(jié)論與討論

銅綠假單胞菌是一種重要的人獸共患病原菌，廣泛存在于天然環(huán)境中，常常引起醫(yī)院病人的獲得性感染，特別是患敗血癥、免疫受損或被抑制的病人，同時(shí)還能升高囊性纖維化病人的發(fā)病率和死亡率[7]。銅綠假單胞菌也能感染狗、貓、豬、水貂、狐貍、貉子等動(dòng)物，疫苗被認(rèn)為是防控感染性疾病最有力的武器[8-9]。近些年來(lái)，眾多有效的銅綠假單胞菌抗原及新的抗原攜帶系統(tǒng)逐漸被篩選與開發(fā)出來(lái)，其中包括一些銅綠假單胞菌的結(jié)構(gòu)部分，如鞭毛、菌毛、脂多糖、外膜蛋白和所分泌的毒素A等物質(zhì)，它們均已被證明是有效疫苗的靶抗原[10]。

一般情況下，細(xì)菌能夠通過(guò)感應(yīng)胞外的信號(hào)來(lái)調(diào)節(jié)代謝以適應(yīng)環(huán)境的變化，銅綠假單胞菌是通過(guò)外膜來(lái)感應(yīng)胞外信號(hào)，這些外膜組分可能作為毒力因子的成分參與侵染過(guò)程[11]。外膜蛋白F在銅綠假單胞菌眾多孔蛋白中占有很少的比例，但它能夠允許離子及小分子的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以非特異性的方式擴(kuò)散[12]。通常情況下，外膜蛋白F被認(rèn)為是一種結(jié)構(gòu)蛋白，能將外膜錨定在肽聚糖層[13]。由于外膜蛋白F位于銅綠假單胞菌的外膜表面，由它介導(dǎo)的病原與宿主之間相互作用的現(xiàn)象被逐漸揭示，許多研究表明，外膜蛋白F確實(shí)參與諸多侵染進(jìn)程，例如它能夠介導(dǎo)病原菌與真核細(xì)胞的黏附[14]，以及厭氧條件下生物膜的形成[15]。此外，外膜蛋白F與IFN-γ相互作用后能夠促使細(xì)菌產(chǎn)生凝集素PA-1L和吩嗪綠膿毒素[16]，這2種毒素的產(chǎn)生表明外膜蛋白F可作為宿主免疫系統(tǒng)的傳感器[17]。與此同時(shí)，外膜蛋白F也可能通過(guò)激活QS系統(tǒng)促使了2種毒素的產(chǎn)生[18-19]。這些研究表明，外膜蛋白F通過(guò)修飾QS系統(tǒng)可增強(qiáng)細(xì)菌的毒力，進(jìn)而介導(dǎo)了與宿主的相互作用，但有趣的是，接種外膜蛋白F和I融合蛋白的人血清能夠抑制銅綠假單胞菌與IFN-γ的結(jié)合，這表明IFN-γ新的作用機(jī)制能夠消除銅綠假單胞菌的毒力[20-21]。因此，外膜蛋白F能夠作為銅綠假單胞菌疫苗的重要候選蛋白，來(lái)防御銅綠假單胞菌的感染。外膜蛋白I也被學(xué)者們廣泛研究，據(jù)報(bào)道，OprI可以結(jié)合到呼吸道和腸道黏膜表面，有望作為黏膜免疫的載體，促進(jìn)抗原傳遞到抗原提呈細(xì)胞[22]。與此同時(shí)，研究者利用重組外膜蛋白I免疫小鼠，小鼠獲得了能夠抵御銅綠假單胞菌攻擊的能力[23]。近些年來(lái)，人們將2種蛋白質(zhì)的重要抗原部位融合表達(dá)發(fā)現(xiàn)，其也具有較好的免疫效果。研究表明，在小鼠模型中，接種OprF-OprI疫苗可以預(yù)防小鼠全身性綠膿桿菌感染[24]。在人體Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)中，為健康志愿者肌肉注射OprF-OprI疫苗，疫苗作用安全且能夠誘導(dǎo)特異性抗體產(chǎn)生[25]。

本研究獲得銅綠假單胞菌的重要外膜蛋白表位基因F1和I2，并將其融合在一起進(jìn)行表達(dá)，為銅綠假單胞菌疫苗的設(shè)計(jì)及開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。融合得到的表位疫苗具有很多優(yōu)勢(shì)，能被具有多種遺傳背景的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子識(shí)別并結(jié)合，從而得到高效的遞呈；它在細(xì)胞免疫方面也具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，可有效應(yīng)對(duì)病原微生物的變異和免疫反應(yīng)中的諸多不利因素。因此，本研究利用pET-28a表達(dá)載體成功表達(dá)了可溶性較好的F1I2融合蛋白，它能與特異性血清發(fā)生較好的反應(yīng)，為F1I2融合蛋白功能的進(jìn)一步研究及新型高效生物制品的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。