不同價態(tài)鉻脅迫對煙草幼苗氮代謝的影響

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(云南農業(yè)大學 煙草學院，云南 昆明 650201)

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試烤煙品種為云煙87和紅花大金元(簡稱紅大)，種子來源于玉溪中煙種子有限責任公司。供試硝酸鉻、重鉻酸鉀以及配制Hoagland營養(yǎng)液所需化學試劑均為分析純，購自西隴化工股份有限公司和天津市風船化學試劑科技有限公司。

1.2 試驗方法

水培試驗于2017年7—12月在云南農業(yè)大學煙草學院日光溫室中進行。采用漂浮育苗體系培育云煙87和紅大幼苗，待煙苗達到貓耳期時，選擇長勢較一致的幼苗移植到盛有500 mL Hoagland營養(yǎng)液(pH值6.0)的水培罐中并用錫箔紙包裹使根部避光，每天通氣2 h，每3 d更換1次培養(yǎng)液(包括指標測定時)。預培養(yǎng)7 d后，向培養(yǎng)液中加入Cr3+、Cr6+溶液。培養(yǎng)液中Cr3+、Cr6+最終質量濃度分別為0(CK)、0.1、0.5、1.0、5.0 mg/L(Cr3+和Cr6+分別由硝酸鉻、重鉻酸鉀提供)，每個處理設3次重復，每罐植煙3株，每個處理共植煙9株，在處理的第15天和第30天取樣測定各指標。

1.3 測定項目及方法

在處理第15天和第30天用打孔器取3～6葉位一定質量的真葉，立即放入液氮中保存，隨后進行相關指標測定。硝態(tài)氮、游離氨基酸、可溶性蛋白含量測定參考王小純等[13]的方法；硝酸還原酶(NR)、谷氨酰胺合成酶(GS)活性和葉綠素含量測定方法參照《植物生理學實驗指導》[14]；谷丙轉氨酶(GPT)活性測定參照吳良歡等[15]的方法。

1.4 數(shù)據處理

試驗數(shù)據用Excel 2013整理，用SPSS 19.0對數(shù)據進行顯著性分析，用Origin 2017進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同價態(tài)鉻對煙草幼苗氮同化的影響

2.1.1 硝態(tài)氮含量 由表1可知，除0.1～0.5 mg/L Cr3+處理30 d的紅大幼葉硝態(tài)氮含量高于CK外，其他處理煙葉硝態(tài)氮含量均低于CK。在不同價態(tài)鉻脅迫下，2個烤煙品種幼葉硝態(tài)氮含量的變化趨勢大致相同：云煙87在Cr3+處理15、30 d和Cr6+處理15 d，以及紅大在Cr3+、Cr6+分別處理15 d，幼葉硝態(tài)氮含量隨鉻質量濃度增加呈先降低后增加再降低趨勢；而Cr6+處理30 d，2個烤煙品種幼葉硝態(tài)氮含量均隨鉻質量濃度增加而降低。其中，云煙87幼葉硝態(tài)氮含量在0.5 mg/L Cr3+處理下達到最高，但處理15、30 d時仍分別較CK降低11.0%、5.8%；而在0.5 mg/L Cr6+處理15、30 d時分別較CK降低14.3%、14.5%。紅大幼葉硝態(tài)氮含量在0.5 mg/L Cr3+處理15、30 d時分別比CK降低15.6%、提高20.05%(P<0.05)；而在0.5 mg/L Cr6+處理15、30 d時分別比CK降低8.1%、22.7%。Cr3+脅迫下，處理30 d的烤煙幼葉硝態(tài)氮含量均高于處理15 d(云煙87 CK除外)。0.1 mg/L Cr6+脅迫下，處理30 d 2個烤煙品種幼葉硝態(tài)氮含量均高于處理15 d； 0.5～5.0 mg/L Cr6+脅迫下則低于處理15 d。0.1～5.0 mg/L Cr6+處理15 d，紅大幼葉硝態(tài)氮含量高于云煙87；高質量濃度鉻(1.0～5.0 mg/L)處理30 d，Cr3+處理的2個烤煙品種幼葉硝態(tài)氮含量高于Cr6+處理。

表1 不同價態(tài)鉻脅迫對煙苗葉片硝態(tài)氮含量的影響 mg/g

注：數(shù)據為平均值±標準誤差；同列不同小、大寫字母分別表示同一品種不同質量濃度鉻處理在5%、1%水平上差異顯著、極顯著，下同。

2.1.2 NR活性 從表2可以看出，Cr3+處理15、30 d，2個烤煙品種幼葉NR活性隨鉻質量濃度增加均呈先降低后升高再降低的趨勢。云煙87、紅大幼葉NR活性分別在0.5、1.0 mg/L Cr3+處理達到峰值，其中，處理15 d時2個品種分別為 9.08、9.07 μg/(g·h)，較CK分別增加18.4%、14.8%，處理30 d時分別為14.26、11.40 μg/(g·h)，較CK分別降低2.6%、8.4%。Cr6+處理下，2個烤煙品種幼葉NR活性隨鉻質量濃度增加而降低，尤其是Cr6+質量濃度增加至>1.0 mg/L后，NR活性極顯著低于CK，但紅大明顯高于云煙87。5 mg/L Cr6+處理15、30 d，紅大幼葉的NR活性較云煙87分別高43.7%、14.8%。相同鉻質量濃度脅迫下，處理30 d的NR活性明顯高于處理15 d。

表2 不同價態(tài)鉻脅迫對煙苗葉片NR活性的影響 μg/(g·h)

2.1.3 GS活性 從圖1可以看出，鉻處理下2個烤煙品種的GS活性均低于CK。Cr3+處理15 d時，云煙87、紅大幼葉GS活性隨鉻質量濃度增大均呈逐漸降低趨勢，其中5 mg/L Cr3+處理下分別較CK顯著降低45.2%、31.8%。Cr3+處理30 d和Cr6+處理15 d時，云煙87、紅大幼葉GS活性隨鉻質量濃度增加均呈先降低后增加再降低的趨勢，二者均在鉻質量濃度為0.5 mg/L 時達到峰值，但仍分別較CK降低1.7%、19.3%(Cr3+處理30 d)和3.0%、12.9%(Cr6+處理15 d)。0.1、0.5 mg/L Cr6+處理15 d 2個烤煙品種幼葉GS活性與CK差異均不顯著。Cr6+處理30 d時，云煙87、紅大幼葉GS活性隨Cr6+質量濃度增加而降低，其中0.1 mg/L Cr6+處理下分別較CK顯著降低21.35%、30.28%。

不同小寫字母表示同一價態(tài)鉻脅迫相同時間不同質量濃度處理間在0.05水平上差異顯著，下同

2.2 不同價態(tài)鉻對煙草幼苗氮轉化的影響

2.2.1 GPT活性 由圖2可以看出，短時間Cr3+處理下，2個烤煙品種幼葉GPT活性呈降低—升高—降低的趨勢。云煙87在0.5 mg/L Cr3+處理15 d時，幼葉GPT活性較CK降低5.1%，而在0.1 mg/L Cr3+處理30 d時GPT活性達到最大值，比CK顯著增加12.8%。紅大在1 mg/L Cr3+處理時幼葉GPT活性達到最大值，處理15、30 d分別比CK提高18.1%、0.4%。Cr6+處理下，隨鉻質量濃度增大，云煙87幼葉GPT活性逐漸降低，0.1 mg/L Cr6+處理30 d時較CK顯著降低34.7%；紅大幼葉GPT活性整體上則呈降低—升高—降低的趨勢，在 1.0 mg/L Cr6+處理下達到峰值，但處理15、30 d仍分別較CK顯著降低30.5%、13.2%?？傮w來看，Cr3+處理下烤煙幼葉GPT活性略高于Cr6+處理，且處理30 d高于處理15 d，紅大高于云煙87。

圖2 不同價態(tài)鉻脅迫對煙苗葉片GPT活性的影響

2.2.2 游離氨基酸含量 由圖3可以看出，不同價態(tài)鉻脅迫15、30 d，2個烤煙品種幼葉游離氨基酸含量均隨鉻質量濃度增加而逐漸降低。除0.1 mg/L Cr3+處理2個品種和Cr6+處理15 d紅大的幼葉游離氨基酸含量與CK無顯著差異外，其他質量濃度Cr3+和Cr6+處理的煙葉游離氨基酸含量均顯著低于CK。1.0 mg/L Cr3+脅迫15、30 d，云煙87幼葉游離氨基酸含量分別較CK降低47.5%、45.7%，紅大幼葉游離氨基酸含量分別較CK降低24.8%、23.7%。1.0 mg/L Cr6+脅迫15、30 d，云煙87幼葉游離氨基酸含量分別較CK降低52.3%、46.1%，紅大幼葉游離氨基酸含量分別較CK降低35.2%、38.5%。整體來看，紅大幼葉內游離氨基酸含量略高于云煙87。

圖3 不同價態(tài)鉻脅迫對煙苗葉片游離氨基酸含量的影響

2.2.3 可溶性蛋白含量 由圖4可知，Cr3+處理15 d，2個烤煙品種幼葉可溶性蛋白含量略有降低，與CK差異不顯著；Cr3+處理30 d，云煙87和紅大幼葉可溶性蛋白含量顯著高于CK，但各脅迫處理間差異不顯著，其中云煙87、紅大幼葉可溶性蛋白含量分別在Cr3+質量濃度為0.1、0.5 mg/L時達到峰值，分別較CK顯著增加15.5%、14.1%。Cr6+處理15 d，云煙87幼葉可溶性蛋白含量顯著低于CK，而紅大各處理可溶性蛋白含量與CK差異不顯著；Cr6+處理30 d，云煙87和紅大幼葉可溶性蛋白含量均高于CK，二者分別在0.1、0.5 mg/L Cr6+處理最高，分別較CK增加13.2%、4.6%。

圖4 不同價態(tài)鉻脅迫對煙苗葉片可溶性蛋白含量的影響

2.3 不同價態(tài)鉻對煙草幼苗色素含量的影響

由圖5可以看出，Cr3+處理15 d，云煙87的葉綠素a、b含量隨鉻質量濃度增加呈先減少后增加再減少趨勢，類胡蘿卜素含量則逐漸降低，0.5 mg/L Cr3+處理時葉綠素b含量達到最大值，較CK顯著增加19.0%；而紅大幼葉的葉綠素a、b和胡蘿卜素含量在Cr3+脅迫15 d較CK提高。0.1～5.0 mg/L Cr3+處理30 d時，2個烤煙品種的葉綠素a和類胡蘿卜素含量與CK相差不大；隨鉻質量濃度增加，云煙87的葉綠素b含量表現(xiàn)為先增加后減少，紅大則表現(xiàn)為減少—增加—減少。Cr6+處理15 d時，云煙87的葉綠素a、b和類胡蘿卜素含量均顯著低于CK；而紅大在0.1～0.5 mg/L Cr6+處理下幼葉葉綠素a和類胡蘿卜素含量較CK提高，葉綠素b含量在0.1 mg/L Cr6+處理時達到最大值。不同質量濃度Cr6+處理30 d，2個烤煙品種的葉綠素a和類胡蘿卜素含量變化較??；0.1～5.0 mg/L Cr6+處理30 d，云煙87的葉綠素b含量隨Cr6+質量濃度增加而逐漸降低，但均顯著高于CK，而紅大的葉綠素b含量則呈現(xiàn)增加—減少—增加的趨勢。云煙87、紅大的幼葉葉綠素b含量分別在0.1、0.5 mg/L Cr6+處理30 d時最高，為8.35、8.72 mg/g，分別比CK增加63.1 %、1.9%。整體來看，Cr3+和Cr6+對云煙87和紅大的葉綠素b含量影響較大。隨著處理時間增加，處理30 d的幼葉葉綠素a和類胡蘿卜素含量高于處理15 d，而葉綠素b含量則低于處理15 d。

A、B為Cr3+處理，C、D為Cr6+處理

3 結論與討論

氮素代謝途徑中多種中間代謝產物或含氮有機物對緩解環(huán)境脅迫起著重要作用[20]。氨基酸和蛋白質是銨態(tài)氮的同化產物，它們對植株的氮代謝以及逆境脅迫下植株的抗性具有重要作用[21]。GPT在氨基酸合成和蛋白質分解代謝中起著重要的中介作用。游離氨基酸含量和GPT活性可部分反映氮轉化的強度。本研究中，低質量濃度(0.1 mg/L)Cr3+處理15 d，2個烤煙品種煙葉游離氨基酸含量減少，可溶性蛋白含量也略有降低，GPT活性降低；處理30 d，游離氨基酸含量減少，可溶性蛋白含量增加，云煙87幼葉GPT活性增加而紅大降低。而Cr6+處理下，GPT活性和游離氨基酸含量隨鉻質量濃度增加而逐漸降低，但處理30 d時各處理可溶性蛋白含量卻高于CK。該結果表明，Cr3+和Cr6+脅迫能減少煙草中的游離氨基酸積累。另外，在相同鉻質量濃度脅迫下，2個烤煙品種的NR、GS、GPT活性，可溶性蛋白、葉綠素a、類胡蘿卜素含量，以及云煙87游離氨基酸含量均表現(xiàn)為處理30 d高于處理15 d，說明隨著脅迫時間延長，煙苗自身生理機制逐漸完善并對鉻傷害產生一定的適應性，從而提高抵抗外界傷害的能力。葉片可溶性蛋白含量增加可能是因為云煙87和紅大煙苗對鉻離子有一個自身適應期，在較長時間內鉻能促進煙草植物細胞蛋白質的合成代謝，誘導合成更多的可溶性蛋白，參與滲透調節(jié)，提高抗逆性，這與張艷英等[18]的研究結果一致。趙全志等[22]在水稻上的研究表明，氮同化酶GS、GOGAT活性高低與葉綠素的合成及葉色變化密切相關。氮作為葉綠素分子的重要組分，對葉綠素的合成和葉綠體的發(fā)育具有重要作用。研究表明，葉綠素含量高，葉片氮代謝旺盛，葉片衰老延緩[23]。本試驗研究中，低質量濃度(0.1 mg/L)Cr3+處理在短時間內增加了紅大的葉綠素a、b和類胡蘿卜素含量；但隨處理時間延長，紅大的葉綠素b和類胡蘿卜素含量略有降低，葉綠素a含量與CK相差不大；0.5 mg/L Cr3+處理15、30 d，云煙87的葉綠素b含量比CK顯著增加，而葉綠素a和類胡蘿卜素含量降低。結果表明，0.5 mg/L Cr3+能促進云煙87葉綠素b含量的積累，降低其葉綠素a和類胡蘿卜素含量，這可能是因為葉綠素b對Cr3+的變化較敏感，具體原因還有待進一步探討。另外，云煙87在0.1～0.5 mg/L Cr3+和Cr6+短時間處理下葉綠素a和類胡蘿卜素含量均低于CK，而紅大則大于CK，說明一定濃度鉻處理一定時間下對云煙87葉綠素a和類胡蘿卜素含量的影響大于紅大。

從氮代謝各指標和葉綠素含量綜合來看，煙苗在生長過程中，氮轉化和氮同化在鉻脅迫初期和低質量濃度鉻脅迫下會表現(xiàn)出一定的增強作用，究其原因，一方面可能是逆境下的煙草通過加強代謝，激活相關保護酶系統(tǒng)來緩解逆境帶來的傷害，另一方面可能是由于補償效應，即植物在結構和生理水平上對閾值內的逆境脅迫條件產生一種利于作物生長發(fā)育的能力，對引起的損失具有彌補作用，是煙株對脅迫的一種本能適應性[24-26]。但隨著脅迫時間延長以及鉻質量濃度的增加，部分氮代謝相關指標和酶活性指標出現(xiàn)降低趨勢，氮轉化和氮同化過程受抑制，最終影響煙苗的氮代謝。

綜上所述，Cr6+對煙葉氮代謝和葉綠素含量的影響大于Cr3+。在0.1～5.0 mg/L鉻處理下，烤煙幼葉的GS活性、游離氨基酸含量均低于CK(無鉻處理)；長時間(30 d)脅迫下，0.5 mg/L Cr3+處理云煙87的硝態(tài)氮、葉綠素b含量和NR、GS活性最高，1.0 mg/L Cr3+和Cr6+處理紅大的GPT活性最高，而高濃度(5.0 mg/L)鉻對2個烤煙品種氮代謝指標的抑制作用最大。鉻脅迫處理30 d烤煙幼葉NR、GS、GPT活性，可溶性蛋白、葉綠素a、類胡蘿卜素含量均高于處理15 d。鉻對紅大和云煙87葉片氮代謝相關指標的抑制作用存在差異。0.1～0.5 mg/L Cr3+和Cr6+處理15 d時，云煙87葉綠素a和類胡蘿卜素含量的降低幅度大于紅大，Cr6+處理下紅大的NR、GS、GPT活性和硝態(tài)氮、氨基酸含量高于云煙87，且云煙87幼葉可溶性蛋白含量受Cr6+影響大于紅大。因此，紅大對鉻脅迫的抵抗力稍強于云煙87，在今后的煙草耐性研究中可考慮選擇紅花大金元作為耐鉻品種進行研究。