持續(xù)性疼痛中“應(yīng)對反應(yīng)”行為相關(guān)通路的確定

一、研究背景

在動(dòng)物和人類面對傷害性刺激的反應(yīng)中，“反射性防御反應(yīng)”是機(jī)體表現(xiàn)出防止或阻止傷害刺激的行為（例如，動(dòng)物和人在接觸到傷害性熱刺激時(shí)會(huì)快速縮手），這是機(jī)體保護(hù)的第一道防線；當(dāng)“反射性防御反應(yīng)”構(gòu)成的第一道防線未能阻止組織損傷時(shí)（例如，手指被燒傷），由此產(chǎn)生的疼痛會(huì)引發(fā)機(jī)體保護(hù)的第二道防線—“應(yīng)對反應(yīng)”行為，并通過產(chǎn)生“應(yīng)對反應(yīng)”來緩解癥狀（例如，舔舐受傷區(qū)域以緩解痛苦）。然而，參與這兩種行為的神經(jīng)通路及其作用機(jī)制依然是不清楚。

前激素肽原1 (preprotachykinin 1, TAC1) 基因表達(dá)在參與傷害刺激反應(yīng)的脊髓神經(jīng)元中。研究人員使用 TAC1Cre小鼠來表征脊髓 TAC1-譜系神經(jīng)元，并獲得了TAC1Cre-tdTomato小鼠、CDX2Flpo-tdTomato小鼠（Flpo 從 CDX2基因位點(diǎn)驅(qū)動(dòng), 能夠切割FRT位點(diǎn)，使終止子之后的tdTomato表達(dá)）和TAC1CDX2-tdTomato小鼠（大腦中的所有tdTomato+纖維起源于TAC1Cre和CDX2Flpo共表達(dá)所定義的脊髓TAC1CDX2神經(jīng)元）用來標(biāo)記與疼痛相關(guān)的特異性上行投射神經(jīng)元。

二、主要研究結(jié)果

1.TAC1Cre標(biāo)記的纖維是脊髓丘腦投射神經(jīng)元的子集，主要終止于內(nèi)側(cè)丘腦

為了研究疼痛相關(guān)行為的上行投射神經(jīng)元，作者利用分子遺傳技術(shù)得到了 TAC1CDX2-tdTomato 小鼠。這種小鼠的大腦中所有 tdTomato+纖維都來源于脊髓 TAC1CDX2神經(jīng)元，TAC1CDX2神經(jīng)元既表達(dá)TAC1Cre又表達(dá)CDX2Flpo。研究人員通過免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，CDX2Flpo標(biāo)記的纖維廣泛分布于丘腦腹后外側(cè)核；TAC1CDX2標(biāo)記的纖維主要分布在室旁、內(nèi)側(cè)丘腦核與外側(cè)核的最內(nèi)側(cè)部分；TAC1Cre標(biāo)記的脊髓投射神經(jīng)元是脊髓丘腦投射神經(jīng)元的一個(gè)子集，在TAC1Cre標(biāo)記的脊髓上行纖維主要終止在內(nèi)側(cè)丘腦，沒有在腹后外側(cè)核中發(fā)現(xiàn)TAC1Cre標(biāo)記的纖維，因此，TAC1Cre標(biāo)記的脊髓神經(jīng)元上行到丘腦終止在丘腦內(nèi)側(cè)，構(gòu)成上行感覺的內(nèi)側(cè)丘腦通路。

2.脊髓TAC1譜系神經(jīng)元與PBsl之間通過選擇性突觸連接，直接或間接連接丘腦內(nèi)核

腦橋臂旁外側(cè)核是沿背腹軸排列的一個(gè)關(guān)鍵中轉(zhuǎn)站，位于臂旁外側(cè)核腹側(cè)外亞核(the external lateral parabrachial nuclei, PBel) 是腦橋臂旁外側(cè)核的重要成份。為了確定PBel投射神經(jīng)元在疼痛中的作用，作者將降鈣素相關(guān)肽基因(calcitonin-gene related peptide,CGRP)表達(dá)在這類神經(jīng)元上，被標(biāo)記的神經(jīng)元然后投射到杏仁核，這些神經(jīng)元對于應(yīng)對外部威脅的快速防御反應(yīng)至關(guān)重要。臂旁外側(cè)核腹亞核 (the dorsoventral lateral parabrachial nuclei, PBdvl) 參與熱行為調(diào)節(jié)；位于最背側(cè)位置的臂旁外側(cè)核上亞核 (the superior lateral parabrachial nuclei, PBsl)則參與疼痛刺激的行為反應(yīng)。通過免疫熒光染色，研究人員發(fā)現(xiàn), TAC1CDX2標(biāo)記的纖維通過腦橋臂旁外側(cè)核區(qū)域PBel和PBdvl側(cè)面，終止于PBsl，TAC1Cre神經(jīng)元與PBsl之間形成特異性突觸連接。PBsl 神經(jīng)元投射到丘腦內(nèi)核，但不投射到杏仁核。因此，脊髓 TAC1譜系神經(jīng)元包括其上升投射神經(jīng)元，直接或間接地連接到丘腦內(nèi)核。

3.TAC1LBX1神經(jīng)元對小鼠功能影響的研究

為了進(jìn)行功能研究，研究人員通過使用TAC1Cre和LBX1F1po（下文稱為TAC1LBX1）共表達(dá)的脊髓神經(jīng)元來表征人白喉毒素受體DTR。TAC1LBX1神經(jīng)元的消融是通過對攜帶tdTomato等位基因的小鼠體內(nèi)注射白喉毒素來完成，在小鼠注射白喉毒素后，攜帶白喉毒素基因的陽性神經(jīng)元被選擇性消融，導(dǎo)致脊髓tdTomato+神經(jīng)元大量減少。白喉毒素消融的神經(jīng)元也出現(xiàn)在三叉神經(jīng)核中，但在背根神經(jīng)節(jié)或其它腦區(qū)域沒有被發(fā)現(xiàn)。為了證明TAC1LBX1神經(jīng)元的功能特性，研究者選擇了TAC1LBX1-Abl小鼠和同窩WT小鼠作為對照，對兩組小鼠的轉(zhuǎn)棒延遲(falling latencies from the rotarod)、溫和刷子刺激(gentle hindpaw brushing)行為反應(yīng)進(jìn)行了比較研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們之間沒有顯著性差異。證明TAC1LBX1神經(jīng)元的消融并不影響感覺運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)，也不參與無害觸覺刺激的反應(yīng)。

4.TAC1LBX1神經(jīng)元是“應(yīng)對反應(yīng)”的必需神經(jīng)元，但不參與“反射性防御反應(yīng)”

行為學(xué)研究表明，當(dāng)TAC1LBX1消融小鼠和野生型小鼠（對照）給予機(jī)械刺激、傷害性瞬時(shí)冷刺激和熱刺激時(shí)，兩組小鼠縮爪反應(yīng)的閾值（潛伏期）未發(fā)生顯著變化；當(dāng)給予電刺激時(shí)，對照組和TAC1LBX1神經(jīng)元消融小鼠行為反應(yīng)也沒有顯著性差異。雖然，PBdv1 中的神經(jīng)元對于行為體溫調(diào)節(jié)是必需的，但對照和TAC1LBX1消融的小鼠并不表現(xiàn)出明顯的溫度偏好。因此，研究人員得出結(jié)論：TAC1LBX1神經(jīng)元對于外部威脅引起的“反射性防御反應(yīng)”是非必需的。然而，在能夠產(chǎn)生組織損傷和疼痛感覺的持續(xù)性有害熱刺激和冷刺激、足底注射TRPA1激動(dòng)劑芥子油、后爪燒傷模擬等行為學(xué)測試中，TAC1LBX1神經(jīng)元消融小鼠的“應(yīng)對反應(yīng)”大大降低，證明TAC1LBX1神經(jīng)元對于不可避免的傷害刺激引起的“應(yīng)對反應(yīng)”是必需的。

5.持續(xù)“應(yīng)對反應(yīng)”的選擇性喪失與人類內(nèi)側(cè)丘腦核病變所見“表型”一致

根據(jù)人體心理物理研究，用彈簧夾夾住皮膚會(huì)引起含有刺痛、疼痛和灼燒成分的疼痛感，人類持續(xù)疼痛評估和小鼠舔的行為在10～15 s內(nèi)都會(huì)到達(dá)一個(gè)峰值，并且在接下來的一分鐘內(nèi)都會(huì)維持這個(gè)峰值水平。在TAC1LBX1消融小鼠中，這種持續(xù)性舔行為已經(jīng)喪失，小鼠的“應(yīng)對反應(yīng)”出現(xiàn)了障礙，這一現(xiàn)象表明TAC1LBX1神經(jīng)元參與了小鼠的“應(yīng)對反應(yīng)”。夾捏刺激能夠誘導(dǎo)小鼠脊髓背角和由脊髓TAC1譜系神經(jīng)元支配的兩個(gè)腦核中（PBs1和內(nèi)側(cè)丘腦復(fù)合體）Fos基因的表達(dá)，而該表達(dá)在TAC1LBX1消融的小鼠中大大減弱。表明情感痛苦的持續(xù)“應(yīng)對反應(yīng)”的選擇性喪失與內(nèi)側(cè)丘腦核病變的人類所見的表型相同，暗示：脊髓TAC1神經(jīng)元與其所支配的腦核具有直接或間接的聯(lián)系。

6.TAC1LBX1神經(jīng)元與持續(xù)疼痛刺激和熱輻射刺激所誘發(fā)“應(yīng)對反應(yīng)”的關(guān)系

前期研究表明，條件性位置厭惡(conditioned place aversion, CPA)實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虼碳AC1Cre的上行投射神經(jīng)元，使小鼠產(chǎn)生厭惡反應(yīng)和厭惡記憶，進(jìn)而產(chǎn)生應(yīng)對反應(yīng)。由此，研究人員開發(fā)了一種夾捏誘發(fā)的CPA模型，在固定隔室對小鼠給予夾捏皮膚刺激，測定不同組小鼠在該隔室的停留時(shí)間來確定小鼠是否產(chǎn)生CPA。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雄雌對照同窩出生的小鼠都表現(xiàn)出夾捏對隔室的厭惡，而消融TAC1LBX1神經(jīng)元的小鼠對這種刺激很不敏感；進(jìn)一步研究表明，能夠使小鼠產(chǎn)生縮足反應(yīng)的重復(fù)輻射熱刺激在對照組或消融組小鼠中都沒有產(chǎn)生CPA，證明TAC1LBX1神經(jīng)元對于由產(chǎn)生持續(xù)疼痛的刺激誘發(fā)的條件性學(xué)習(xí)和記憶是必需的，而對于熱輻射引起的反射性防御反應(yīng)是非必需的，表達(dá)TAC1Cre上行投射系統(tǒng)的激活是產(chǎn)生CPA的原因。

7.TRPV1、MRGPRD與“反射性防御反應(yīng)”和“應(yīng)對反應(yīng)”

TRPV1+傷害感受器對于皮膚夾捏、冷板刺激、熱板刺激或皮膚燒傷引起的舔行為是必需的，但不影響縮足反應(yīng)；MRGPRD+傷害感受器消融導(dǎo)致縮足閾值增加但不影響小鼠的舔行為。研究人員發(fā)現(xiàn)，在TAC1Cre標(biāo)記的神經(jīng)元中，夾捏誘導(dǎo)的Fos表達(dá)在消除TRPV1+時(shí)減少，這表明這些神經(jīng)元之間具有功能性聯(lián)系。值得注意的是，雖然TRPV1+傷害感受器對由有害熱引起的反射和舔行為都是必需的，但是這些行為中的每一個(gè)都可能涉及單獨(dú)的神經(jīng)元群。通過應(yīng)對試驗(yàn)，研究人員發(fā)現(xiàn)與反射性防御試驗(yàn)得出的結(jié)論相反：需要TRPV1+而不是MRGPRD+傷害感受器來驅(qū)動(dòng)持續(xù)性機(jī)械疼痛。

三、結(jié)論

動(dòng)物和人類對傷害刺激表現(xiàn)出兩種類型的反應(yīng)，一種是“反射性防御反應(yīng)”，另一種是“應(yīng)對反應(yīng)”。不論是“反射性防御反應(yīng)”還是“應(yīng)對反應(yīng)”，傷害刺激傳遞主要有兩條通路，一是脊髓-丘腦通路，刺激信號(hào)由脊髓丘腦投射神經(jīng)元的子集，終止于內(nèi)側(cè)丘腦通路；二是從脊髓神經(jīng)元，通過PBel和PBdvl側(cè)面連接PBsl，最終投射到丘腦內(nèi)側(cè)細(xì)胞核，但并不投射到杏仁核。

TAC1LBX1神經(jīng)元的消融并不影響感覺運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)，也不參與無害觸覺刺激的反應(yīng)，對外部威脅引起的“反射性防御反應(yīng)”沒有影響；而對于不可避免的傷害刺激引起的“應(yīng)對反應(yīng)”是必需的。表明TAC1LBX1神經(jīng)元是脊髓中介導(dǎo)“應(yīng)對反應(yīng)”行為的神經(jīng)元。

TRPV1+傷害感受器在有害熱刺激引起的反射和舔行為中都發(fā)揮了作用；MRGPRD+傷害感受器只影響“防御性反射反應(yīng)”，不參與驅(qū)動(dòng)持續(xù)性機(jī)械疼痛。