金屬蛋白酶在椎間盤退行性變中的研究進(jìn)展*

周小莉 洪瑩瑩 詹玉林

（1上海中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)系，上海 200000，2上海海洋大學(xué)生物學(xué)系，上海 200000，3上海健康醫(yī)學(xué)院附屬第六人民醫(yī)院東院骨科，上海 200000）

腰痛是一種極其常見的健康問題，其造成的殘疾比其他任何疾病都要多，而在2010年的全球疾病負(fù)擔(dān)調(diào)查中，腰痛在291個(gè)原因里高居第6位[1]。除卻生理上的痛苦、經(jīng)濟(jì)上的壓力，其亦常導(dǎo)致病人心理上的焦慮抑郁狀態(tài)[2]。而越來越多的證據(jù)表明，腰痛與椎間盤退行性變 (intervertebral disc degeneration, IDD)密切相關(guān)。盡管椎間盤退行性變的發(fā)生機(jī)制并未完全清楚，但諸多研究提示髓核細(xì)胞外基質(zhì) (extracellular matrix, ECM) 的降解是其主要的特征性改變之一。

ECM主要成分是II型膠原和蛋白聚糖，使髓核能夠保留水分，從而緩沖和吸收機(jī)體上的負(fù)荷。在健康的椎間盤中，由于生長(zhǎng)因子和分解代謝細(xì)胞因子的復(fù)雜調(diào)節(jié)，ECM的合成和分解速率處于平衡狀態(tài)，而當(dāng)ECM的分解代謝超過其合成代謝時(shí)，膠原蛋白和蛋白聚糖的丟失，椎間盤退變得以發(fā)生、發(fā)展[3]。而基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)和具有血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶 (a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs, ADAMTSs) 是切割膠原蛋白和蛋白聚糖的主要酶，其各自成員在退行性變的椎間盤中的高表達(dá)，與ECM分解和IDD進(jìn)展密切相關(guān)[4]。針對(duì)IDD的治療，臨床上仍停留在比較片面的對(duì)癥處理上，待疾病惡化到一定程度則采取手術(shù)治療，對(duì)于如何延緩甚至逆轉(zhuǎn)該病的進(jìn)程尚缺乏有效的手段。本文綜述近年來關(guān)于MMPs和ADAMTSs在IDD中的表達(dá)和作用的報(bào)道，并總結(jié)了一些以此為基礎(chǔ)的治療方法的最新進(jìn)展，以期為治療該疾病提供新的思路。

1.正常椎間盤的組成及功能

椎間盤是脊柱椎體之間的功能單位，由三部分構(gòu)成：堅(jiān)韌的層狀纖維環(huán) (annulus fibrosus, AF)、軟質(zhì)凝膠狀髓核 (nucleus pulposus, NP) 以及上下兩端各一的軟骨終板 (endplates, EP)。椎間盤各組分之間協(xié)同合作，作為椎體之間的減震器，應(yīng)對(duì)脊柱的彎曲和扭轉(zhuǎn)[5]。

AF由15～25個(gè)同心層組成 ，每層厚約0.05～0.5 mm，厚度從外到內(nèi)逐漸增加。在健康的椎間盤中，AF含有約65%～70%的水，干重約為20%蛋白多糖，干重約50%～70%膠原，干重約2%的彈性蛋白以及其他非膠原成分。從外層向內(nèi)層，蛋白多糖、水和II型膠原蛋白含量增加，而I型膠原蛋白含量降低。I型膠原蛋白可提供張力，而II型膠原蛋白形成細(xì)小的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)結(jié)合蛋白多糖，從而可與水結(jié)合，使組織能夠承受壓力[6]。

NP是膠質(zhì)結(jié)構(gòu)，富含II型膠原和蛋白聚糖，還包括少量的VI，IX和XI型膠原。II型膠原蛋白約占干重的5%～20%，提供松散的三維纖維網(wǎng)絡(luò)。在蛋白聚糖中，聚集蛋白聚糖是最常見的類型，約占NP干重的50%，在吸水過程中起著關(guān)鍵作用，NP的高含水量使其表現(xiàn)出響應(yīng)于壓縮載荷而增加的流體靜壓，使其具備應(yīng)對(duì)機(jī)體壓力的能力[7]。

2.ECM在椎間盤退行性變過程中的變化

在健康的椎間盤中，ECM的合成和分解速率處于平衡狀態(tài)，當(dāng)分解超過合成時(shí)常發(fā)生椎間盤退變。通常情況下在退化的早期階段膠原蛋白合成有所增加，NP內(nèi)II型膠原合成增加較為明顯，這可能意味著機(jī)體嘗試進(jìn)行修復(fù)機(jī)制。隨著退變的進(jìn)一步進(jìn)行，II型膠原含量顯著降低，且I型膠原在纖維內(nèi)環(huán)及髓核中形成更強(qiáng)的韌性纖維，而蛋白聚糖的改變，特別是聚集蛋白聚糖的降解，則是退變中更為初始且關(guān)鍵的表現(xiàn)[8]。

ECM組成變化所帶來的結(jié)果是對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)的變化，包括椎間盤高度的降低及纖維環(huán)層狀損害，也可能導(dǎo)致整個(gè)椎間盤運(yùn)動(dòng)節(jié)段的機(jī)械應(yīng)力顯著改變。聚集蛋白聚糖的降解所帶來的水分的丟失，導(dǎo)致NP承受壓力的能力下降，較高的壓縮載荷轉(zhuǎn)移至AF，損害其結(jié)構(gòu)和功能，出現(xiàn)裂縫、翹曲或破裂等情況，導(dǎo)致椎間盤進(jìn)一步損害。

3.MMPs和ADAMTSs的生物學(xué)特性

（1）MMPs的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及分類

MMPs是一類鈣依賴性、含鋅內(nèi)肽酶的一個(gè)非常大的家族，迄今為止在人體中共檢驗(yàn)到24種基質(zhì)金屬蛋白酶，其中包括MMP-23基因的兩個(gè)復(fù)制表達(dá)?；诘孜锾禺愋?、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位，基質(zhì)金屬蛋白酶可分為六類：膠原酶，明膠酶，基質(zhì)溶素，基質(zhì)金屬蛋白酶，膜型基質(zhì)金屬蛋白酶和其他類型。其中膠原酶 (MMP-1、-8、-13和-18) 主要作用于纖維狀膠原蛋白；明膠酶 (MMP-2和-9)作用于變性的膠原蛋白、明膠和層粘連蛋白；基質(zhì)溶素蛋白酶 (MMP-3、-10和-11) 可以蛋白水解多種底物，包括蛋白多糖、明膠、膠原等；基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMP-7和-26) 可作用于多種ECM組分，包括聚集蛋白聚糖，以及生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子；膜型金屬蛋白酶 (MMP-14、-17、-24和-25) 定位于質(zhì)膜，具有影響細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，并且可能激活其他MMPs[9]。其余的金屬蛋白酶 (MMP-12、-19、-20、-21、-23、-27和-28) 也參與組織基質(zhì)穩(wěn)態(tài)和修復(fù)，但是它們的底物特異性尚未明確。這些基質(zhì)金屬蛋白酶通常以非活性形式分泌，需要其他調(diào)控激活蛋白激活，這種調(diào)節(jié)確保各種基質(zhì)金屬蛋白酶在組織生長(zhǎng)、修復(fù)和重塑方面具有相應(yīng)的時(shí)間和空間活性[10]。

（2）ADAMTSs的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及分類

ADAMTSs是較晚發(fā)現(xiàn)的與ECM成分結(jié)合的金屬蛋白酶家族，由19名成員組成。根據(jù)其結(jié)構(gòu)功能的不同，可分為四類：聚集蛋白聚糖酶、膠原蛋白N-肽酶、血管性血友病因子和其他類型。其中聚集蛋白聚糖酶 (ADAMTS-1、-4、-5、-8、-9、-15和-20)，可以粗略地描述為具有蛋白多糖分解作用，盡管還有其他報(bào)道的功能，例如調(diào)節(jié)血管生成等；膠原蛋白N-肽酶 (ADAMTS-2、-3和-14)，它們具有合成代謝功能，作用于膠原類型I，II和III的前膠原等；血管性血友病因子 (ADAMTS-13)，可參與凝血機(jī)制，并且該蛋白質(zhì)的突變與血栓性血小板減少性紫癜相關(guān)；其余的ADAMTS (-6、-7、-10、-12、-16、-17、-18和-19) 功能尚不確切[11]。

4.MMPs和ADAMTSs在正常椎間盤與退變椎間盤中的表達(dá)

（1）MMPs在正常與退變椎間盤中的表達(dá)

MMPs在正常的椎間盤中表達(dá)很低，甚至沒有，而少量的表達(dá)可能是由于參于正常組織的修復(fù)和重塑所致。在嬰幼兒及青少年的椎間盤中，在細(xì)胞核或纖維環(huán)內(nèi)幾乎無MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-9的免疫組化反應(yīng)，而在15歲以上人群的椎間盤中檢測(cè)到顯著表達(dá)的MMP-1、MMP-2和MMP-3，偶可檢測(cè)到MMP-9[12]。

相較于正常椎間盤，退行性變的椎間盤中可檢測(cè)到更多的MMPs的表達(dá)。一項(xiàng)研究分析了椎間盤退變分級(jí)與MMP-1表達(dá)的關(guān)系，并比較了不同年齡組之間的差異，結(jié)果表明隨著退變分級(jí)的增加，MMP-1的表達(dá)逐漸上調(diào)，且老年組椎間盤MMP-1表達(dá)明顯高于青年組[13]。Takahashi等報(bào)道了椎間盤中MMP-3為響應(yīng)機(jī)械負(fù)荷后的增加，且因其表達(dá)導(dǎo)致的椎間盤退變程度可隨時(shí)間加重[14]。Maitre等證實(shí)在髓核的軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞中MMP-7的表達(dá)隨著組織學(xué)級(jí)別的退化加重而增加，其可降解椎間盤的主要基質(zhì)分子，并伴隨許多其他蛋白酶和細(xì)胞因子的激活，且對(duì)TIMP-1的抑制具有抗性，在椎間盤退化中起著重要作用[15]。Stephen等發(fā)現(xiàn)在有癥狀的椎間盤退變中MMP-10表達(dá)增加，其可能促成基質(zhì)降解，并成為疼痛感受出現(xiàn)的開端[16]。MMP-12可在退變椎間盤中檢出，其不僅參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解，且與細(xì)胞因子和趨化因子的活性相關(guān)[17]。

（2）ADAMTSs在正常與退變椎間盤中的表達(dá)

ADAMTS-1、-4、-5、-9和-15在正常椎間盤和退變椎間盤中均可存在，在正常椎間盤中表達(dá)的意義可能在于在生理功能中發(fā)揮作用，對(duì)比后發(fā)現(xiàn)ADAMTS-1、-4、-5、-9、-15在退變椎間盤中表達(dá)較多[18]。Patel等利用免疫印跡法比較退變?cè)缙诤屯砥谌祟愖甸g盤中ADAMTS-4和ADAMTS-5蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ADAMTS-4在晚期變性組織中的含量高于早期，而ADAMTS-5在兩個(gè)階段中的含量沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[19]。Gruber等人對(duì)比了退變程度不同的椎間盤后發(fā)現(xiàn)，ADAMTS-3和ADAMTS-10在高程度退變的椎間盤中的表達(dá)較低程度的更低[20]。因此，在椎間盤退行性變的進(jìn)程中ADAMTSs的表達(dá)模式尚不確切，仍需進(jìn)一步探索研究。

5.MMPs與ADAMTSs在IDD中的調(diào)控

腰椎間盤退行性變是一個(gè)復(fù)雜且多因素的病變過程，涉及的機(jī)制尚未完全闡明，但可以明確的是由MMPs和ADAMTSs介導(dǎo)的ECM的降解在此過程中起著關(guān)鍵性的作用。目前部分文獻(xiàn)報(bào)道了已通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)的部分金屬蛋白酶的作用機(jī)制，以及與其表達(dá)密切相關(guān)的通路和因子。

（1） MMPs在IDD中的調(diào)控

考慮到椎間盤在變性期發(fā)生了細(xì)胞外基質(zhì)組分的碎裂，而ECM的蛋白水解片段加重了IDD。Quero等用片段透明質(zhì)酸 (fragment Hyaluronic Acids, fHAs) 處理健康椎間盤細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)了MMP-1和-13的mRNA高表達(dá)，此外還發(fā)現(xiàn)fHAs依賴于絲裂原活化蛋白 (mitogen-activated protein, MAP) 激酶信號(hào)傳導(dǎo)通路增強(qiáng)MMP-3蛋白產(chǎn)生的能力[21]。Hsien等發(fā)現(xiàn)神經(jīng)生長(zhǎng)因子 (nerve growth factor, NGF) 可增加Lcn2的表達(dá)，該因子可保護(hù)MMP-9并上調(diào)表達(dá)，加大MMP-9與其抑制劑的比例，同時(shí)可以協(xié)同MMP-9來增強(qiáng)對(duì)基質(zhì)的降解[22]。另一項(xiàng)研究則表明miR-146a抑制IL-1誘導(dǎo)的MMP-13的表達(dá)，當(dāng)miR-146a 敲除小鼠的椎間盤離體培養(yǎng)于IL-1環(huán)境下3天后，表現(xiàn)出了較對(duì)照組更嚴(yán)重的退變，并伴隨著MMP-13表達(dá)的升高[23]。

（2）ADAMTSs在IDD中的調(diào)控

大量研究證實(shí)聚集蛋白聚糖的喪失是椎間盤組織退變的早期關(guān)鍵變化，ADAMTS-4和ADAMTS-5由于其在切割聚集蛋白聚糖中的高效率而被歸類為主要聚集蛋白聚糖酶，故而成為探索重點(diǎn)。Wang等證實(shí)TNF-α處理后的人類椎間盤細(xì)胞中ADAMTS-4和ADAMTS-5呈現(xiàn)高表達(dá)，隨后通過促進(jìn)NF-κB通路來刺激聚集蛋白聚糖和Col II的分解代謝[24]。另一項(xiàng)研究表明TNF-α和IL-1β通過SDC4通路促進(jìn)ADAMTS-5的高表達(dá)來加強(qiáng)聚集蛋白聚糖的降解[25]。而經(jīng)IL-1β處理的大鼠NP細(xì)胞表現(xiàn)出ADAMTS-4的高表達(dá)及聚集蛋白聚糖降解的顯著增加，也歸因于MAPK和NF-κB通路的激活[26]。Li等報(bào)道了肥胖癥人群中瘦素 (leptin)的過度表達(dá)可以顯著上調(diào)ADAMTS-4和ADAMTS-5的表達(dá)，并且通過誘導(dǎo)p38磷酸化來降低聚集蛋白聚糖的水平，也證實(shí)了肥胖確為IDD發(fā)病的高危因素[27]。

6.在IDD中以MMPs和ADAMTSs為靶點(diǎn)的治療方法研究進(jìn)展

基于前人關(guān)于金屬蛋白酶的探索，近年來有許多研究以此為靶點(diǎn)，在化學(xué)、基因?qū)W、再生醫(yī)學(xué)等多方面探尋IDD的治療方法。

有研究表明鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠表現(xiàn)出NP形態(tài)的特異性退行性改變，并且MMP-13和ADAMTS-5高表達(dá)，而用戊聚糖多硫酸鹽和吡哆胺的聯(lián)合治療通過降低MMP-13和ADAMTS-5水平緩解了NP的變性[28]。Sun等用NF-κB特異性抑制劑BAY11-7082作用于暴露在IL-1β中的髓核細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其可降低MMP-3、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-4和ADAMTS-5的表達(dá)，聚集蛋白聚糖和II型膠原的低表達(dá)也得到了逆轉(zhuǎn)[29]。

金屬蛋白酶的組織抑制劑-1 (tissue inhibitor of metalloproteinases 1, TIMP-1) 是一種特異于MMP-3或溶基質(zhì)蛋白的TIMP家族成員，已經(jīng)在退化的椎間盤和軟骨中被檢測(cè)到，增強(qiáng)TIMP-1的表達(dá)可增強(qiáng)人退化椎間盤細(xì)胞中的蛋白多糖合成[30]。Leckie等將攜帶TIMP-1基因的腺相關(guān)病毒血清型2 (adenovirus associated virus 2, AAV2)載體注射到兔IDD模型的椎間盤中，結(jié)果顯示椎間盤中的II型膠原含量顯著增加，MRI評(píng)估的退變程度也較對(duì)照組輕[31]。由此亦可證實(shí)增加ECM的生產(chǎn)在延緩IDD中的益處。

間充質(zhì)干細(xì)胞 (mesenchymal stem cell, MSC) 具有長(zhǎng)期自我更新和多向分化的潛能，Miyamoto等將MSCs注射到兔的髓核中，發(fā)現(xiàn)其可以在椎間盤中持續(xù)存在24周，通過降低MMP-2，MMP-3、MMP-13的表達(dá)并促進(jìn)II型膠原的增加，從而抑制椎間盤的退變進(jìn)程[32]。一項(xiàng)研究已將MSC用于臨床試驗(yàn)，在MRI的指導(dǎo)下將兩名慢性腰痛的病人的人臍帶組織來源MSC移植到相應(yīng)椎間盤組織中，移植后2例病人疼痛和活動(dòng)功能隨即好轉(zhuǎn)，視覺模擬量表 (visual analog scale, VAS) 和Oswestry殘疾指數(shù) (oswestry disability index, ODI) 評(píng)分在2年隨訪期間明顯下降，且未觀察到明顯的不良反應(yīng)[33]。證實(shí)了MSC移植在IDD治療中的可行性。

此外，近年來中醫(yī)藥以金屬蛋白酶為媒介，在IDD治療方面的研究亦取得了長(zhǎng)足進(jìn)展。Yang等用大鼠制備補(bǔ)腎活血方血清，以體外實(shí)驗(yàn)方法作用于人退變椎間盤NP細(xì)胞，結(jié)果顯示MMP-3和ADAMTS-5蛋白水平顯著降低，而蛋白聚糖和II膠原蛋白水平增加[34]。Huang等發(fā)現(xiàn)五倍子酸可通過調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路中p65的磷酸化和乙?；瘉斫档褪笏韬思?xì)胞中ADAMTS-4的表達(dá)，從而延緩椎間盤退變的進(jìn)程[35]。而蟲草素可通過抑制NF-κB通路激活的方法降低退化NP細(xì)胞中ADAMTS-4、-5的表達(dá)來減輕椎間盤退化程度[36]。

7.結(jié)論

綜上所述，ECM的降解確為椎間盤退變中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，金屬蛋白酶在其中的作用也不言而喻。應(yīng)對(duì)方法旨在通過增加合成代謝或降低分解代謝來調(diào)節(jié)基質(zhì)的平衡以避免IDD或延緩其進(jìn)程。結(jié)合相關(guān)研究看來，盡早采取措施來減少分解代謝的益處是明確的，同時(shí)需考慮到在退化的、機(jī)械應(yīng)力改變的環(huán)境中促進(jìn)椎間盤細(xì)胞合成代謝所面臨的困難。另外，細(xì)胞外基質(zhì)不僅存在于椎間盤組織中，而金屬蛋白酶在整個(gè)身體中均發(fā)揮了重要作用，針對(duì)MMPs和ADAMTSs的抑制必須是具有組織特異性的，并準(zhǔn)確定位于椎間盤。目前研究主要以動(dòng)物定點(diǎn)注射和人類組織體外培養(yǎng)為主，在人類椎間盤內(nèi)直接注射可能導(dǎo)致的意外也需慎重考慮，而全身給藥能否達(dá)到足夠、有效的椎間盤內(nèi)濃度也是需探索的方向。另外，選擇治療手段時(shí)，對(duì)病人癥狀的治療也不可忽視，應(yīng)以提高病人的生活質(zhì)量為首要目標(biāo)。值得欣喜的是，祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)為這一疾病的治療研究提供了更廣闊的空間，這也將是未來著重探索的方向。