常見(jiàn)癌痛動(dòng)物模型的優(yōu)缺點(diǎn)及在中醫(yī)藥中的應(yīng)用*

張 震 稅會(huì)利 陳志平 王鏡輝 黃雯琪 楊 兵 楊 柱 唐東昕

（貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，貴陽(yáng) 550002）

癌性疼痛在許多腫瘤病人中普遍存在，目前對(duì)于癌性疼痛的治療依然以西醫(yī)的癌痛三階梯止痛原則為主[1]，其他治療方法包括手術(shù)、放化療等，但是西醫(yī)的各種治療方法不良反應(yīng)較大，在治療的同時(shí)也讓病人痛苦不堪，近年來(lái)中醫(yī)藥在臨床癌性疼痛的治療中效果顯著，目前研究顯示，中醫(yī)藥治療癌痛療效確切，可顯著改善病人癥狀，提高病人生活質(zhì)量，且不良反應(yīng)少。對(duì)于癌痛研究的關(guān)鍵是各種模型的建立，相應(yīng)的動(dòng)物模型是研究癌痛的基礎(chǔ)。建立可靠的癌痛動(dòng)物模型，將有利于研究癌性疼痛的基本作用機(jī)制，對(duì)開(kāi)發(fā)治療癌性疼痛的藥物和方法具有重要意義。各種癌痛模型的建立也經(jīng)過(guò)了漫長(zhǎng)的探索與不斷地革新，本文對(duì)目前常見(jiàn)的癌痛動(dòng)物模型的造模方法、優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行論述，希望為癌性疼痛的研究提供造模參考。同時(shí)對(duì)各種癌痛模型在中醫(yī)藥中的應(yīng)用進(jìn)行論述，為進(jìn)一步開(kāi)展中醫(yī)藥治療癌性疼痛的機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

一、骨癌痛模型的發(fā)展

骨癌痛在癌痛中疼痛十分劇烈而且很難有效止痛。所以對(duì)骨癌痛研究最關(guān)鍵的是骨癌痛模型的建立。世界上第一個(gè)小鼠股骨癌痛模型于1999年被美國(guó)的Schiwei成功建立，隨后其它部位的骨癌痛動(dòng)物模型大量出現(xiàn)[2]。2002年Medhurst等成功構(gòu)建脛骨癌痛模型[3]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，脛骨骨癌痛模型可視為轉(zhuǎn)移性骨癌痛模型，因?yàn)槊劰枪前┩磩?dòng)物表現(xiàn)出來(lái)的疼痛和臨床的轉(zhuǎn)移性骨癌痛表現(xiàn)相似。同時(shí)該模型疼痛檢測(cè)方法簡(jiǎn)單，易于操作，是目前十分理想的研究骨癌痛動(dòng)物模型。

二、脛骨骨癌痛模型的制備

目前對(duì)于脛骨癌痛模型的建立，癌細(xì)胞常選取Walker256乳腺癌細(xì)胞，動(dòng)物選取普通雌性Wistar大鼠，將Walker256乳腺癌細(xì)胞注射到大鼠腹腔進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，收集大鼠腹水，離心收集細(xì)胞[4]。參照Medhurst[3]等的方法建立模型。首先對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉。大鼠達(dá)到麻醉標(biāo)準(zhǔn)后，將其仰臥位固定于操作臺(tái)上。將大鼠左側(cè)小腿脛骨部位剃毛、消毒。切開(kāi)脛骨下段小心暴露脛骨骨面。用直徑為1 mm不銹鋼轉(zhuǎn)頭進(jìn)行打孔，但要防止打穿。然后用微量注射器將含有大鼠Walker256乳腺癌細(xì)胞的腹水注入骨髓腔，注射后迅速用骨蠟封閉鉆孔處，用75%乙醇消毒傷口，傷口進(jìn)行逐層縫合。整個(gè)操作嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作。

關(guān)于骨癌痛模型的疼痛行為的檢測(cè)方法[5～8]包括機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏(randall-selitto test)，自發(fā)疼痛行為學(xué)改變、熱痛覺(jué)過(guò)敏、機(jī)械性異常性疼痛(von Frey)。通過(guò)上述方法可對(duì)骨癌痛模型進(jìn)行檢測(cè)。

三、脛骨骨癌痛模型的優(yōu)點(diǎn)和其注意事項(xiàng)及不足之處

目前脛骨骨癌痛模型所選擇的細(xì)胞多來(lái)自自體接種大鼠產(chǎn)生的腹水瘤細(xì)胞，其來(lái)源相同，可直接進(jìn)行腹腔注射。目前已經(jīng)廣泛用于各種動(dòng)物模型的建立[9]。目前應(yīng)用廣泛的為Walker256細(xì)胞，其具有比較強(qiáng)的骨侵襲能力；而且細(xì)胞活力強(qiáng)，可在大鼠腹腔內(nèi)大量增殖。對(duì)于手術(shù)方法也有改變，以往所采用的是脛骨平臺(tái)入路，手術(shù)中對(duì)大鼠脛骨組織分離的程度很難把握，因此對(duì)術(shù)后的觀察指標(biāo)會(huì)造成很大的干擾。目前更多的采用脛骨中下段鉆孔注入腹水瘤細(xì)胞，中下段脛骨皮膚較薄，無(wú)肌肉覆蓋，很容易暴露骨頭，創(chuàng)面小出血少，完成后為避免細(xì)胞外溢需要用骨蠟快速封閉創(chuàng)口。也可以選擇用注射器針頭進(jìn)行鉆孔，將10 μl注射器的針頭彎成120?！?50。讓針尖盡可能多地進(jìn)入骨髓腔，接種細(xì)胞后用骨蠟快速封閉鉆孔處。骨癌痛模型的制備不足之處在于前期的細(xì)胞培養(yǎng)為體內(nèi)培養(yǎng)，而不是通過(guò)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，其培養(yǎng)成本較高，培養(yǎng)周期較長(zhǎng)。培養(yǎng)細(xì)胞使用的大鼠一般要選擇離乳的幼鼠為最佳，周齡和體重過(guò)大對(duì)于細(xì)胞的培養(yǎng)會(huì)產(chǎn)生一定的影響。選擇注射的腹水瘤細(xì)胞盡量避免選擇含有血性腹水的細(xì)胞，大量研究表明血性腹水的細(xì)胞注射到骨髓腔內(nèi)后，大鼠死亡率較高[10]。此外造模時(shí)需要制備者有一定的外科水平，對(duì)骨的解剖結(jié)構(gòu)和骨科手術(shù)有一定的臨床經(jīng)驗(yàn)，初學(xué)者以及沒(méi)有外科基礎(chǔ)者需要反復(fù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)才能熟練掌握。有文獻(xiàn)表明骨癌痛模型大鼠在造模后28天左右多死于惡液質(zhì)[10]。因此對(duì)于一些口服中藥止痛的觀察可能會(huì)因?yàn)楣辔钢芷谳^短而不能有效觀察中藥的止痛效果及中藥制劑治療癌性疼痛的機(jī)制。此外脛骨骨癌痛模型并不能代表所有骨癌痛，其它部位的骨癌痛模型也需要進(jìn)一步的研究探索。

四、骨癌痛模型在中醫(yī)藥的廣泛應(yīng)用

中醫(yī)藥在治療骨癌痛方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，其方法多樣，副作用小，作用持久，臨床應(yīng)用廣泛。但是對(duì)于中藥治療癌痛的作用機(jī)制研究較少。王玉等[11]在成功建立骨癌痛動(dòng)物模型基礎(chǔ)上，研究乳腺癌術(shù)后骨轉(zhuǎn)方對(duì)癌痛大鼠疼痛行為及脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響，結(jié)果表明乳腺癌術(shù)后骨轉(zhuǎn)方的鎮(zhèn)痛機(jī)制可能是通過(guò)抑制脊髓水平星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP、SP、CGRP的表達(dá)發(fā)揮止痛作用。付桃芳等[12]在成功建立骨癌痛動(dòng)物模型基礎(chǔ)上，對(duì)模型大鼠連續(xù)腹腔注射嗎啡治療，11天后成功建立癌痛大鼠嗎啡耐受模型。通過(guò)觀察嗎啡治療前后應(yīng)用電針治療骨癌痛的效果，研究發(fā)現(xiàn)電針治療可以延長(zhǎng)癌痛大鼠嗎啡耐受形成的時(shí)間，對(duì)于已經(jīng)產(chǎn)生耐受的骨癌痛大鼠，電針治療可以部分逆轉(zhuǎn)耐受，恢復(fù)嗎啡對(duì)骨癌痛大鼠的治療效果。骨癌痛動(dòng)物模型的建立對(duì)于中醫(yī)藥在骨癌痛治療的機(jī)制和新藥的研究提供了良好的研究工具。

五、化療痛模型的優(yōu)缺點(diǎn)及應(yīng)用

化療藥物誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛，簡(jiǎn)稱化療痛[13]。其疼痛機(jī)制和藥物的神經(jīng)毒性有關(guān)。其化療痛動(dòng)物模型的建立方法通常是將化療藥物注射到動(dòng)物體內(nèi)，使之產(chǎn)生痛覺(jué)過(guò)敏反應(yīng)。化療痛模型的制備和骨癌痛模型相比，其制備方法簡(jiǎn)單可行，而且制備經(jīng)濟(jì)成本低。不需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。而且化療痛模型一般形成的機(jī)械或熱痛覺(jué)過(guò)敏十分穩(wěn)定，對(duì)于化療痛的機(jī)制研究和抗癌痛藥物的篩選具有重要的意義。但是通過(guò)各種化療藥物構(gòu)建的化療痛癌痛模型也存在一定的不足之處。如通過(guò)長(zhǎng)春新堿構(gòu)建的癌痛模型產(chǎn)生的痛覺(jué)過(guò)敏和痛覺(jué)異常和劑量有關(guān)，而且如果持續(xù)腹腔注射長(zhǎng)春新堿會(huì)導(dǎo)致模型老鼠運(yùn)動(dòng)功能障礙和較高的死亡率，因此該模型的應(yīng)用在一定程度上受到了限制。而且隨著各種新型化療藥物的研發(fā)和應(yīng)用。新型化療藥物癌痛模型的構(gòu)建仍需深入的研究。目前的化療痛模型大多是神經(jīng)病理性疼痛模型，化療引起的內(nèi)臟痛和骨痛動(dòng)物模型至今尚未成功構(gòu)建。

目前，化療痛的機(jī)制尚不明確，國(guó)內(nèi)外均尚未發(fā)現(xiàn)有效的藥物和方法能預(yù)防或控制這一并發(fā)癥。因此化療痛的發(fā)病機(jī)制以及治療化療痛的新藥開(kāi)發(fā)是目前該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。目前化療痛動(dòng)物模型已經(jīng)廣泛應(yīng)用于研究治療化療痛藥物的篩選及藥物治療化療痛的分子機(jī)制當(dāng)中。中醫(yī)藥在臨床中廣泛應(yīng)用于治療化療引起的癌性疼痛。其療效確切，可以達(dá)到增效減毒的作用。眭明紅等[14]通過(guò)腹腔注射紫杉醇制備紫杉醇誘導(dǎo)的化療機(jī)械痛模型，通過(guò)該模型觀察電針“足三里”對(duì)紫杉醇誘導(dǎo)的化療機(jī)械痛小鼠痛閾的影響及持續(xù)時(shí)間，探討其鎮(zhèn)痛機(jī)制。觀察結(jié)果表明電針能有效抑制紫杉醇誘導(dǎo)的化療所致周圍神經(jīng)痛，其鎮(zhèn)痛機(jī)制可能與降低血液促炎細(xì)胞因子有關(guān)。鐘敏鈺等[15]通過(guò)對(duì)成年雄性SD大鼠腹腔注射紫杉醇成功制備大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型，通過(guò)該模型觀察川芎嗪和普瑞巴林對(duì)大鼠疼痛的治療效果以及探討其止痛機(jī)制，研究結(jié)果表明川芎嗪和普瑞巴林對(duì)該化療痛模型老鼠具有止痛效果，二者療效相似而且聯(lián)合用藥具有協(xié)同增效的作用，其作用機(jī)制可能是通過(guò)降低神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)生長(zhǎng)因子的表達(dá)來(lái)減輕神經(jīng)損傷，達(dá)到止痛的效果。建立適合的化療痛動(dòng)物模型為中醫(yī)藥在化療痛的發(fā)病機(jī)制和新藥的研究提供了良好的研究工具。

六、皮膚癌癌痛模型的優(yōu)缺點(diǎn)及應(yīng)用

皮膚癌死亡的主要原因之一是惡性黑色素瘤，絕大多數(shù)病人在確診時(shí)已進(jìn)展到晚期,因此死亡率極高[16]。雖然疼痛不是臨床上黑色素瘤的主要癥狀，但仍有7%的病人出現(xiàn)疼痛。此外，轉(zhuǎn)移性黑色素瘤與疼痛有關(guān)（在某些情況下是神經(jīng)性疼痛），超過(guò)50%的病人需要姑息治療和嗎啡治療。因此對(duì)于皮膚癌的研究和治療刻不容緩。此外，接種腫瘤細(xì)胞到后肢足底的動(dòng)物表現(xiàn)出明顯的痛覺(jué)過(guò)敏[17]。因此可以在后肢足底皮下注射腫瘤細(xì)胞構(gòu)建皮膚癌癌痛模型。通過(guò)在動(dòng)物后肢足底皮下注射瘤細(xì)胞構(gòu)建的癌痛模型較骨癌痛模型方法操作簡(jiǎn)單易行，成瘤率高。對(duì)于疼痛的檢測(cè)方法也較骨癌痛模型簡(jiǎn)單，只需通過(guò)熱、機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏進(jìn)行檢測(cè)，無(wú)需病理X線片檢測(cè)。但是皮膚癌癌痛模型仍存在一定的不足之處，目前皮膚癌癌痛模型選擇的部位大多數(shù)局限于四肢部位的皮膚，其余部位的皮膚癌癌痛模型目前尚未成功構(gòu)建。同時(shí)對(duì)于足趾部的癌痛模型有文獻(xiàn)表明皮下注射瘤細(xì)胞14 d后足趾部位出現(xiàn)破潰、出血，因此此種癌痛模型無(wú)法對(duì)口服中藥制劑的止痛療效和作用機(jī)制進(jìn)行研究[18]。常用于對(duì)注射用止痛藥物的療效檢測(cè)及機(jī)制研究。

近年來(lái)足跖皮膚癌是繼骨癌痛和化療痛模型之后，建立的一種新的癌痛模型。目前雖然皮膚癌癌痛模型的種類較少，但是皮膚癌癌痛模型得成功建立為研究探索皮膚癌癌痛的機(jī)制和新型治療藥物提供了一個(gè)很好的平臺(tái)。謝榮等[19]通過(guò)將腫瘤細(xì)胞經(jīng)皮下注射到小鼠左后爪跖面，小鼠表現(xiàn)出疼痛行為學(xué)的改變，成功建立足趾皮膚腫瘤模型。通過(guò)該模型研究鞘內(nèi)注射阿米洛利，檢測(cè)其對(duì)小鼠疼痛行為學(xué)的影響以及脊髓背角中ASIC-3蛋白表達(dá)。通過(guò)鞘內(nèi)注射阿米洛利給藥后，觀察發(fā)現(xiàn)阿米洛利可提高癌性疼痛引起的小鼠熱痛閾值，減輕小鼠熱痛覺(jué)過(guò)敏行為反應(yīng)，同時(shí)可以抑制小鼠脊髓背角ASIC-3通道蛋白的表達(dá)。該研究結(jié)果為臨床治療皮膚癌引起的疼痛提供了新的思路。Tabata等[20]通過(guò)在小鼠后肢皮下注射黑色素瘤細(xì)胞成功構(gòu)建黑色素瘤皮膚動(dòng)物模型。通過(guò)該動(dòng)物模型觀察TrkA的抑制肽對(duì)腫瘤誘導(dǎo)的小鼠黑色素瘤疼痛模型產(chǎn)生的影響，研究結(jié)果表明，TrkA受體抑制肽通過(guò)減少小鼠皮膚癌疼痛模型中足爪體積的增加，從而明顯減輕黑色素瘤引起的疼痛。

七、其它癌痛模型的優(yōu)缺點(diǎn)及應(yīng)用

目前臨床上出現(xiàn)的神經(jīng)性癌痛也很普遍。對(duì)于神經(jīng)性癌痛動(dòng)物模型目前研究較為廣泛的是通過(guò)腫瘤壓迫坐骨神經(jīng)成功建立的神經(jīng)性癌痛模型[21]。張文學(xué)等[22]將S180肉瘤細(xì)胞接種在坐骨神經(jīng)肌肉叢中，然后觀察小鼠的疼痛行為學(xué)改變，成功建立小鼠坐骨神經(jīng)癌痛模型。評(píng)價(jià)神經(jīng)痛的普遍檢測(cè)方法包括自發(fā)性行為學(xué)評(píng)分、熱痛覺(jué)過(guò)敏和機(jī)械刺激等[23]。將腫瘤細(xì)胞接種在坐骨神經(jīng)周圍的肌肉中該造模方法較骨癌痛模型操作方法簡(jiǎn)單，成本低，周期短，成模后模型穩(wěn)定，可重復(fù)性好。而且該模型與癌癥病人腫瘤壓迫坐骨神經(jīng)產(chǎn)生的疼痛高度相似，可廣泛用于癌性疼痛的治療和疼痛機(jī)制的研究。

但是其它部位的神經(jīng)痛動(dòng)物模型目前還很少，如胰腺癌神經(jīng)痛動(dòng)物模型。經(jīng)查閱大量文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)一篇關(guān)于胰腺癌癌痛模型的研究，現(xiàn)作一簡(jiǎn)要總結(jié)。Wang等[24]將胰腺癌細(xì)胞系SW 1990細(xì)胞移植到雌性BALB/c裸鼠胰腺上，在本研究中，小鼠胰腺癌所致疼痛模型引起小鼠明顯的駝背行為和肌肉過(guò)敏反應(yīng)。通過(guò)測(cè)量腹部皮膚的機(jī)械閾值檢查來(lái)觀察疼痛的行為反應(yīng)。通過(guò)該模型對(duì)脊髓背角與疼痛相關(guān)的10個(gè)特異性基因進(jìn)行了相關(guān)研究。

大多數(shù)口腔癌是口腔黏膜上皮細(xì)胞產(chǎn)生的鱗狀細(xì)胞癌?？谇话┨弁磭?yán)重影響病人的生活，以往的研究很少報(bào)道以鱗狀細(xì)胞癌為動(dòng)物模型研究癌性疼痛產(chǎn)生的分子機(jī)制。最近katsunori等[25]將鱗癌細(xì)胞(scc-158)接種于雄性Fisher大鼠牙齦造成牙齦癌痛模型，根據(jù)該模型研究牙齦癌痛產(chǎn)生的病理機(jī)制，采用藥理和免疫組織化學(xué)方法研究TRPV1、TRPV2在三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)結(jié)果，研究結(jié)果表明，TRPV1、TRPV2上調(diào)三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元可能在誘導(dǎo)的機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏中起著重要的作用，此外星型膠質(zhì)細(xì)胞的活化可能參與痛覺(jué)的形成。這將成為口腔癌疼痛治療的新靶點(diǎn)。

八、結(jié)語(yǔ)

目前對(duì)于癌痛的治療仍不理想，其病理機(jī)制仍不明確。近年來(lái)臨床應(yīng)用中醫(yī)藥治療癌痛的研究越來(lái)越廣泛。雖然中醫(yī)藥的止痛療效十分顯著，但是其作用機(jī)制卻并不明確。各種癌性疼痛動(dòng)物模型的成功建立為研究癌性疼痛的病理機(jī)制和中醫(yī)藥的作用機(jī)制提供了良好的平臺(tái)和理論依據(jù)。但是癌性疼痛的種類繁多，目前建立的癌痛動(dòng)物模型并不能滿足所有的癌性疼痛的研究，如食管癌、肺癌等腫瘤引起的內(nèi)臟痛模型很少有研究。同時(shí)在各種造模前可對(duì)動(dòng)物的基礎(chǔ)痛閾值進(jìn)行檢測(cè)，以排除動(dòng)物自身基礎(chǔ)痛閾值偏高或偏低引起后期檢測(cè)的干擾，使癌痛模型更加科學(xué)、合理、規(guī)范。因此對(duì)于癌性疼痛動(dòng)物模型的研究依然刻不容緩，相信隨著科技的進(jìn)步和對(duì)癌性疼痛的不斷深入研究，在未來(lái)更多的理想的癌痛動(dòng)物模型將會(huì)被成功建立，我們希望將來(lái)更多療效確切的中醫(yī)藥治療癌痛的方法能夠通過(guò)各種癌痛模型來(lái)證實(shí)其功效并深入研究其作用機(jī)制，加快中醫(yī)藥治療癌痛的研究與推廣。