復(fù)方丹參片對(duì)急性血瘀模型大鼠血液流變學(xué)的影響

郭玉東 左澤平 高 陽 胡宇馳 曹春然 王志斌 李 麗

（北京市藥品檢驗(yàn)所，北京 100035）

復(fù)方丹參片是含丹參的一種制劑，主要含有丹參、三七和冰片，具有活血化瘀，理氣止痛的功效，用于治療氣滯血瘀所致的胸悶（癥見胸悶，心前區(qū)刺痛）、冠心病和心絞痛。復(fù)方丹參片臨床使用量很大，然而不同廠家生產(chǎn)的質(zhì)量參差不齊，藥典質(zhì)量控制方法不能完全反應(yīng)其活性，因此對(duì)復(fù)方丹參片進(jìn)行藥效再評(píng)價(jià)，并篩選合適的活性指標(biāo)用于其質(zhì)量控制。本實(shí)驗(yàn)采用皮下腎上腺素加冰浴法制備大鼠血瘀模型，觀察復(fù)方丹參片對(duì)血瘀模型大鼠血液流變學(xué)的影響，旨在探討復(fù)方丹參片活血化瘀可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

品系：SD大鼠；級(jí)別：SPF級(jí)；許可證號(hào)：SCXK（京）2006-0009；由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

0.9%氯化鈉注射液，批號(hào)：12080542（國藥集團(tuán)容生制藥有限公司）；水合氯醛，批號(hào)：20110509（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；凝血酶原時(shí)間（PT）測(cè)定試劑盒，批號(hào)：NO620322（Instrumentation Laboratory）；活化部分凝血酶原時(shí)間（APTT）測(cè)定試劑盒，批號(hào)：NO716816（Instrumentation Laboratory）；二磷酸腺苷ADP，濃度：5μmol/L（北京世帝科學(xué)儀器公司）；鹽酸腎上腺素注射液（Adrenalin hydrochloride，縮寫為 Adr），批號(hào)：1209251（天津金耀氨基酸有限公司）；枸櫞酸納，批號(hào)：20110604（北京化學(xué)試劑公司）

1.3 實(shí)驗(yàn)藥品

復(fù)方丹參片（0.32 g/片，60片/盒，用法用量：一日三次，一次三片，北京同仁堂），批號(hào)：12120393；阿斯匹林泡騰片 （0.5 g/片），批號(hào)：1211032。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

TE2101-L電子天平（北京塞多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），LG-R-80B血液黏度儀（北京世帝科學(xué)儀器公司），MEK-6318血液分析儀（北京健長醫(yī)療器械有限公司），LG-PABER血小板聚集凝血因子分析儀（北京世帝科學(xué)儀器公司），LG-B-190紅細(xì)胞變形聚集測(cè)試儀（北京世帝科學(xué)儀器公司），ACL ELITE PRO全自動(dòng)血凝儀（Instrumentation Laboratory）。

1.5 方法

1.5.1 動(dòng)物分組及急性血瘀模型的制備：SD大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量190～220 g，隨機(jī)分為6組，分別為模型組、正常對(duì)照組（不皮下注射鹽酸腎上腺素給予等體積的生理鹽水）、陽性藥組（阿斯匹林泡騰片）、復(fù)方丹參片高、中、低劑量組。阿斯匹林泡騰片組給藥劑量2.5 mg/kg，復(fù)方丹參片高、中、低劑量組分別為0.68、0.34、0.17 g/kg，模型組和空白組給予生理鹽水，給藥體積均為1.0 mL/100 g，連續(xù)給藥6 d后，除正常組外，各組動(dòng)物皮下注射鹽酸腎上腺素注射液0.9 mg·kg-1，共2次，間隔4 h，在第一次皮下注射Adr 2 h后將大鼠置于冰水中3 min，第二次皮下給Adr后造成血瘀證模型[1-2]，造模1 h后給藥1次，然后禁食12 h[3]。于取血前1 h再給藥1次，腹腔注射4%水合氯醛麻醉大鼠，供取血用。

1.5.2 復(fù)方丹參片對(duì)血瘀模型大鼠血小板數(shù)、血小板聚集率及紅細(xì)胞壓積的測(cè)定：從上述血瘀模型大鼠腹主動(dòng)脈取血5 m L，加3.2% 枸櫞酸鈉抗凝（血液與抗凝劑體積比9∶1），以1 000 r/min離心10 m in，制備富血小板血漿（PRP），剩余血液經(jīng)2 500 r/min離心 15 min，制備貧血小板血漿（PPP）[4]。用全血分析儀測(cè)定RPR中血小板數(shù)及紅細(xì)胞壓積。測(cè)定血小板聚集時(shí)取PPP 200μL調(diào)零，然后分別取PRP 190μL，加入誘導(dǎo)劑 ADP（終濃度5μmol/L）10μL，測(cè)定血小板5 min最大聚集率，血小板聚集測(cè)定均在4 h內(nèi)完成。

1.5.3 復(fù)方丹參片對(duì)血瘀模型大鼠凝血時(shí)間和纖維蛋白原含量的測(cè)定：取貧血小板血漿（PPP），采用全自動(dòng)血凝儀測(cè)定凝血酶原時(shí)間（PT）、凝血酶時(shí)間（TT）、活化部分凝血酶原時(shí)間（APTT）[5]和纖維蛋白原含量，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。

1.5.4 復(fù)方丹參片對(duì)血瘀模型大鼠血液黏度及血漿的測(cè)定：從上述血瘀模型大鼠腹主動(dòng)脈取的血中取1 m L，注入含有3.2% 枸櫞酸鈉抗凝（抗凝劑與血液比例為1∶9）的試管中，充分混勻，取血0.8 mL測(cè)量全血黏度，取上述貧血小板血漿（PPP）0.8 m L測(cè)量血漿黏度[6]。

1.5.5 復(fù)方丹參片對(duì)血瘀模型大鼠紅細(xì)胞變形、聚集的測(cè)定：從上述血瘀模型大鼠腹主動(dòng)脈取的血中取2 m L，注入含有3.2% 枸櫞酸鈉抗凝（抗凝劑與血液比例為1∶9）的試管中，充分混勻，分別取血0.8 m L，用紅細(xì)胞變形聚集測(cè)試儀測(cè)定紅細(xì)胞的變形和聚集。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

以上測(cè)定結(jié)果采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行組間的方差分析，考察模型組和空白組之間以及各給藥組和模型組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方丹參片對(duì)血瘀模型大鼠紅細(xì)胞壓積、血小板數(shù)及最大聚集率的影響

結(jié)果見表1，復(fù)方丹參片能夠降低模型大鼠紅細(xì)胞壓積，中、小劑量組與模組相比有顯著性差異（P＜0.01），大劑量組降低幅度較小。同時(shí)復(fù)方丹參片能降低模型大鼠血漿中血小板數(shù)，降低血小板最大聚集率，抑制血小板聚集作用，與模型組相比大、中劑量均有顯著性差異（P＜0.01）。由以上結(jié)果還可以看出，血小板數(shù)的多少與血小板最大聚集率具有一定的相關(guān)性。

表1 復(fù)方丹參片對(duì)血瘀模型大鼠紅細(xì)胞壓積、血小板數(shù)及最大聚集率的影響（±s±s，n=10）Tab le 1 The effects of com pound danshon tab lets on erythrocyte deposition，p latelet coun t and m axim um aggregation rate of b lood stasism odel rats（±s±s，n=10）

表1 復(fù)方丹參片對(duì)血瘀模型大鼠紅細(xì)胞壓積、血小板數(shù)及最大聚集率的影響（±s±s，n=10）Tab le 1 The effects of com pound danshon tab lets on erythrocyte deposition，p latelet coun t and m axim um aggregation rate of b lood stasism odel rats（±s±s，n=10）

注：**P＜0.01 vs模型組；▲▲P＜0.01 vs空白組Note：**P＜0.01 vsmodel group；▲▲P＜0.01 vs blank group

空白780.7±80.9 34.0±2.4 38.0±14.2模型 / 900.3±87.8 55.4±8.2▲▲ 59.3±7.9▲▲阿斯匹林 0.0025 673.7±151.5** 43.9±7.6** 36.5±8.6**大劑量 0.68 696.5±112.4** 49.1±6.5 38.2±9.3**中劑量 0.34 781.4±144.3 45.4±7.3** 44.0±8.8**小劑量 0.17 832.7±113.2 43.6±7.5**/48.8±11.7

2.2 復(fù)方丹參片對(duì)血瘀模型大鼠 TT、PT、APTT和FIB的影響

結(jié)果見表2，復(fù)方丹參片能夠降低模型大鼠血漿中纖維蛋白原含量，與模型組相比大、中劑量有顯著性差異（P＜0.01），小劑量無顯著性差異（P＞0.05）。同時(shí)具有一定延長模型大鼠凝血酶原（PT）和活化部分凝血酶原（APTT）凝集時(shí)間作用，其中大劑量組延長APTT凝集時(shí)間的作用較為明顯，與模型組相比差異顯著（P＜0.01），中和小劑量無顯著性差異（P＞0.05）。復(fù)方丹參片延長凝血酶（TT）和凝血酶原（PT）凝集時(shí)間作用較小，各劑量組與模型組相比無顯著性差異（P＞0.05）。

表2 復(fù)方丹參片對(duì)血瘀模型大鼠凝血時(shí)間的影響（±s±s，n=10）Tab le 2 The effects of com pound danshon tab lets on coagu lation tim e of b lood stasism odel rats（ ±s ±s，n=10）

表2 復(fù)方丹參片對(duì)血瘀模型大鼠凝血時(shí)間的影響（±s±s，n=10）Tab le 2 The effects of com pound danshon tab lets on coagu lation tim e of b lood stasism odel rats（ ±s ±s，n=10）

注：**P＜0.01 vs模型組；▲▲P＜0.01 vs空白組Note：**P＜0.01 vsmodel group；▲▲P＜0.01 vs blank group

?

2.3 復(fù)方丹參片對(duì)血瘀模型大鼠血液黏度的影響

結(jié)果見表3，復(fù)方丹參片能降低血瘀模型大鼠全血黏度及血漿黏度，模型組與空白組相比有顯著性差異（P＜0.01），且明顯高于空白組，提示模型成立。復(fù)方丹參片的大劑量的高切和中切與模型組相比均有顯著性差異（P＜0.01），低切與模型組相比大劑量差異顯著（P＜0.05），中、小劑量對(duì)全血黏度 的影響不大。血漿黏度與模型組相比大劑量有顯著 性差異（P＜0.01），中劑量差異顯著（P＜0.05），小 劑量無顯著性差異。其中大劑量降低全血黏度及血 漿黏度的作用效果較為明顯，并具有較為明確的劑 量關(guān)系。

表3 復(fù)方丹參片對(duì)血瘀模型大鼠血液黏度的影響（±s±s，n=10）Tab le 3 The effects of com pound danshon tab lets on the b lood viscosity of b lood stasism odel rats（±s±s，n=10）

表3 復(fù)方丹參片對(duì)血瘀模型大鼠血液黏度的影響（±s±s，n=10）Tab le 3 The effects of com pound danshon tab lets on the b lood viscosity of b lood stasism odel rats（±s±s，n=10）

注：*P＜0.05，**P＜0.01 vs模型組；▲▲P＜0.01 vs空白組Note：*P＜0.05， **P＜0.01 vsmodel group；▲▲P＜0.01 vs blank group

?

2.4 復(fù)方丹參片對(duì)血瘀模型大鼠紅細(xì)胞變形聚集的影響

結(jié)果見表4，復(fù)方丹參片能夠降低血瘀模型大鼠紅細(xì)胞聚集能力，減小聚集指數(shù)和曲線下的聚集面積，中小劑量與模型組相比具有顯著性差異（P＜0.05），大劑量差異不明顯。復(fù)方丹參片在一定程 度上也能增加模型大鼠紅細(xì)胞變形能力，但與模型 相比無顯著性差異。

表4 復(fù)方丹參片對(duì)血瘀模型大鼠紅細(xì)胞變形聚集的影響（±s±s，n=10）Tab le 4 The effects of com pound danshon tab lets on the deform ation and accum u lation of erythrocytes of blood stasism odel rats（±s ±s，n=10）

表4 復(fù)方丹參片對(duì)血瘀模型大鼠紅細(xì)胞變形聚集的影響（±s±s，n=10）Tab le 4 The effects of com pound danshon tab lets on the deform ation and accum u lation of erythrocytes of blood stasism odel rats（±s ±s，n=10）

注：*P＜0.05vs模型組；▲▲P＜0.01 vs空白組Note：*P＜0.05vsmodel group；▲▲P＜0.01 vs blank group

0.09±0.04 16.1±8.3 0.74±0.04 363.5±28.0模型 / 0.64±0.25▲▲ 122.5±47.6▲▲ 0.69±0.05 337.7±31.4阿司匹林 0.0025 0.36±0.18* 69.8±35.9* 0.72±0.04 355.1±28.3大劑量 0.68 0.53±0.25 103.2±50.8 0.71±0.04 346.5±25.0中劑量 0.34 0.38±0.26* 73.4±53.9* 0.72±0.04 356.5±27.1小劑量 0.17 0.39±0.14* 75.3±29.9*空白/0.72±0.04 351.2±24.0

3 討論

血液流變學(xué)是研究循環(huán)血液的流動(dòng)性、變形性、凝固性、黏彈性以及心血管黏滯性的科學(xué)?，F(xiàn)代藥理研究表明，當(dāng)人體患某種疾病，尤其是心血管系統(tǒng)疾病時(shí)，血液的流變性發(fā)生異常，從而引起全身或局部循環(huán)和微循環(huán)障礙[7]。目前臨床上血液的濃、黏、凝、聚是造成心腦血管疾病的重要原因[8]，本實(shí)驗(yàn)采用的急性大鼠血瘀模型模擬人類血液流變異常改變臨床表現(xiàn)，考察復(fù)方丹參片活血化瘀可能的作用機(jī)理。

全血黏度主要取決于紅細(xì)胞數(shù)量的多少和性能，血漿的黏度主要取決于血漿蛋白的含量[9]。全血黏度的增高會(huì)引起紅細(xì)胞變形性降低和聚集性增高，使黏度進(jìn)一步增高，使血流進(jìn)一步變慢，這樣有利于血小板的黏附和聚集[10]；血漿黏度的增高會(huì)使血液的凝固性增加；最終導(dǎo)致心血管疾病[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)方丹參片能夠降低血瘀模型大鼠全血及血漿的黏度，進(jìn)一步降低紅細(xì)胞聚集，同時(shí)能夠抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集作用，這可能是復(fù)方丹參片活血化瘀的主要作用機(jī)理。

本文研究發(fā)現(xiàn)復(fù)方丹參片能夠降低實(shí)驗(yàn)性急性血瘀模型大鼠的全血黏度、血漿黏度、纖維蛋白原含量、紅細(xì)胞聚集、血小板數(shù)和血小板最大聚集率。此種藥理作用對(duì)于防止動(dòng)脈硬化的發(fā)展，防止急性心肌梗死時(shí)的高黏狀態(tài)、并發(fā)癥以及預(yù)防及控制部分腦血管疾病的發(fā)生均有較好作用，為復(fù)方丹參片臨床作為預(yù)防和治療血瘀證、改善微循環(huán)提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

通過本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，復(fù)方丹參片能夠明顯改善急性血瘀模型大鼠血液流變狀態(tài)，并通通過指標(biāo)分析，發(fā)現(xiàn)復(fù)方丹參片活血化瘀的主要立足點(diǎn)可能是降低血液黏度和抑制血小板聚聚，如果能夠圍繞這兩項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)一步分析，找到復(fù)方丹參片的治療作用通路及靶點(diǎn)，將能進(jìn)一步提高復(fù)方丹參片的質(zhì)量和療效。