覆盆子對尼古丁戒斷焦慮征大鼠的影響*

邢宇雙 梁啟超 金賁臨 梁憶紅 雷 濤 楊 志 吳宜艷

（1.牡丹江醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，牡丹江 157011）（2.牡丹江醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，牡丹江 157011）（3.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院研究生處，齊齊哈爾161006）

尼古丁、阿片類藥物的濫用、依賴和成癮是亞洲、北美洲、東南歐等許多國家和地區(qū)日益嚴(yán)重的社會問題。當(dāng)前，對尼古丁、嗎啡等藥物成癮后的戒斷治療是學(xué)者們研究的熱點問題[1-2]。美國精神病協(xié)會認(rèn)為尼古丁依賴主要是由于個體反復(fù)攝取尼古丁所導(dǎo)致的一種慢性易復(fù)發(fā)的綜合癥，這是一類神經(jīng)活性物質(zhì)濫用所致的疾病[3]。尼古丁依賴滿足美國精神疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)DSM-Ⅳ中對物質(zhì)依賴的診斷標(biāo)準(zhǔn)，這一診斷標(biāo)準(zhǔn)包括沖動性使用，停藥困難，慢性使用后停藥會產(chǎn)生戒斷癥狀。尼古丁依賴包括軀體依賴和精神依賴。軀體依賴又稱生理依賴，即反復(fù)攝入尼古丁，當(dāng)停止用藥則會發(fā)生一系列癥狀與體征，且令人難以忍受。這些癥狀與體征包括煩躁不安、易怒、焦慮、情緒低落、注意力不集中、失眠、心率降低、食欲增加、抑郁等。精神依賴又稱心理依賴，俗稱心癮，尼古丁的精神依賴表現(xiàn)為對尼古丁的強烈渴求[4]。

覆盆子為薔薇科懸鉤子屬植物，具有補腎固精、助陽等功效。大量研究表明覆盆子果實中富含鞣花酸、多糖、花青素、超氧化物、多酚類、黃酮、超氧化物歧酶等[5-6]，具有抗衰老、治療泌尿道感染、減肥、抗癌防癌、保護(hù)心臟、抗氧化、降血脂、降血糖、防止心血管疾病等藥理作用[7-13]，但針對覆盆子的抗焦慮作用卻鮮有報道。本實驗研究覆盆子提取物對尼古丁戒斷大鼠焦慮征的作用，并探討其作用機制，為覆盆子的功能開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SD雄性大鼠，體質(zhì)量220～250 g：由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動物室提供。

1.2 實驗藥品及試劑

覆盆子：購于牡丹江天利醫(yī)藥（經(jīng)生藥學(xué)鑒定為薔薇科懸鉤子屬植物華東覆盆子的果實）；尼古?。嘿徲谏虾r代生物科技有限公司；氯化鈉注射液（0.9%）：哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司批號 140409F3；磷酸二氫鉀：天津博迪化工股份有限公司批號140606分析純；去甲腎上腺素鹽酸鹽：上?；鶎嵥帢I(yè)有限公司批號 20140513；甲醇：天津市永大化學(xué)試劑有限公司批號 20150104色譜純；高氯酸：哈爾濱試劑化工廠批號 20141201分析純；地西泮：天津金耀藥業(yè)有限公司。

1.3 實驗儀器

高效液相色譜儀LC2103：上海天美科學(xué)儀器有限公司 Kromasil 100-5C18 250x4.6 mm；離心機：eppendorf centrifuge 5424； 勻 漿 機： motor cordless749540-0000；高架十字迷宮：上海欣軟信息科技有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 覆盆子提取物的制備：取干燥的中藥覆盆子500 g磨成細(xì)粉，于乙醇中回流提取，過濾，減壓蒸發(fā)，凍干。提取物根據(jù)凍干粉的干重估計，產(chǎn)率為10.6%。

1.4.2 建立尼古丁成癮模型劑量設(shè)計：選取健康SD雄性大鼠40只，體質(zhì)量（220～250）g，隨機分為空白對照組（生理鹽水），模型對照組（0.4 mg/kg尼古?。幬飳φ战M（0.4 mg/kg尼古丁 +地西泮），覆盆子高劑量組（0.4 mg/kg尼古丁+覆盆子提取物200 mg/kg），覆盆子低劑量組（0.4mg/kg尼古丁+覆盆子提取物100 mg/kg）。除空白組外，其余4組每天皮下注射尼古丁0.4 mg/kg/d，共7 d，制備尼古丁成癮模型。最后一次注射尼古丁后24 h，藥物對照組給予地西泮（根據(jù)臨床劑量0.1 mg/kg體質(zhì)量），覆盆子高、低劑量組分別灌胃覆盆子提取物200 mg/kg、100 mg/kg，連續(xù) 5 d，最后一次給藥 1 h后，用高架十字迷宮測其焦慮行為。

1.4.3 行為學(xué)指標(biāo)測試：高空十字架是由2個開放臂和2個閉合臂以及1個中心部分（10 cm×10 cm）組成。若大鼠在開放臂的時間探索增加，那么其焦慮程度較低，若大鼠在開放臂的探索時間減少，那么其焦慮程度較高。實驗室內(nèi)光線昏暗并保持恒亮，室溫24℃，并保持安靜。將每只大鼠置于高空十字架（EPM）的正中央（頭面向開放臂）釋放，大鼠在迷宮中的行為被視頻跟蹤系統(tǒng)自動記錄，每只大鼠測試時間為5 m in，實驗人員在距離測試箱2 m處觀察并記錄下大鼠的活動狀況。每一只動物完成測試后，清理糞便，并對裝置用酒精進(jìn)行徹底清潔消毒。

測試指標(biāo)：進(jìn)入到開放臂次數(shù)（OE open arm entry）：即進(jìn)入到任一開放臂的次數(shù)，以大鼠 4個爪均進(jìn)入到臂內(nèi)開始，中途有1個爪從該臂中完全撤出，那么該次進(jìn)入活動完成；進(jìn)入到開放臂的時間（OT open arm time）：進(jìn)入到開放臂停留的時間，單位：秒（s）；進(jìn)入到閉合臂次數(shù)（CE close arm entry）：即進(jìn)入到任一閉合臂的次數(shù)，以大鼠4個爪均進(jìn)人到臂內(nèi)開始；進(jìn)入到閉合臂時間（CT close arm time），進(jìn)入到閉合臂停留的時間，單位：秒（s）。 由以上指標(biāo)分別計算出：①進(jìn)入到開放臂和閉合臂的總次數(shù)（OE+CE）：表示大鼠的自發(fā)活動（locomotor activity）；② 進(jìn)開放臂次數(shù)比例（OE%）=OE/（OE+CE）×100%；③開放臂停留時間比例（OT%）=OT/（OT+CT） ×100%

1.4.4 海馬中去甲腎上腺素（NE）的含量測定：所有大鼠都完成高架十字迷宮（EPM）測試后，立即將每只大鼠斷頭處死，將大腦放在冰盤上，剪開顱蓋和腦膜，剝離組織后，迅速取出左右兩側(cè)海馬，稱其質(zhì)量后，立刻放入-80℃的液氮中保存，之后轉(zhuǎn)移到-80℃低溫冰箱里存放。

繪制線性回歸方程：取去甲腎上腺素（NE）標(biāo)準(zhǔn)品約2.5 mg，精密稱定，用0.1 mol/L HClO4溶解并定容到50 m L作為對照品貯備液。精密吸取貯備液10、20、40、80、160 μL，分別稀釋成 1.25、2.5、5、10、20ng/μL，以濃度（c）為橫坐標(biāo)（X），峰面積（A）為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，得出回歸方程。

海馬中去甲腎上腺素（NE）的含量測定：在海馬樣品中加入-4℃保存的0.1 mol/L高氯酸處理液0.1 g/m L，置于冰水混合物中用勻漿機勻漿1 min。將上述物質(zhì)放入離心機中，以15 000 r/m in離心20 min，吸取上清液。將上清液再次以15 000 r/min離心20 m in，上清液以0.22μm的微孔濾膜過濾。以50μL微型注射器吸取20μL進(jìn)樣，高效液相色譜系統(tǒng)檢測。

色譜條件色譜柱為4.6×250 mm，Kromasi 100-5Cl8，流動相為甲醇∶磷酸二氫鉀（0.15 mol/L pH=5.5） =1∶9等度洗脫，流速為 l m L/min，室溫，波長280 nm，樣品中各主要組分用外標(biāo)法進(jìn)行定量。

1.5 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 覆盆子提取物對大鼠OE%和OT%的影響

結(jié)果顯示（表1）：在高架十字迷宮中，與空白對照組相比，尼古丁戒斷大鼠在開放臂的逗留次數(shù)、時間明顯減少（P＜0.05）；與模型對照組相比，藥物對照組能增加其次數(shù)、時間（P＜0.05），覆盆子高劑量提取物作用效果更顯著（P＜0.01）。

表1 覆盆子對尼古丁戒斷大鼠進(jìn)入開放臂次數(shù)比（OE%）、開放臂停留時間比（OT%）的影響（±s ±s）Table 1 Effects of raspberry on the ratio of open arm s to OE%and open arm stay tim e（OT%）in nicotine w ithd raw al rats（ ±s ±s）

表1 覆盆子對尼古丁戒斷大鼠進(jìn)入開放臂次數(shù)比（OE%）、開放臂停留時間比（OT%）的影響（±s ±s）Table 1 Effects of raspberry on the ratio of open arm s to OE%and open arm stay tim e（OT%）in nicotine w ithd raw al rats（ ±s ±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型對照組相比，#P＜0.05，##P＜0.01Note： Compared with the blank control group， *P＜0.05， **P＜0.01； compared with the model control group， #P＜0.05，##P＜0.01

空白對照組8 45.97±5.55 49.69±3.19模型對照組 8 29.78±10.60* 32.85±4.69**覆盆子高劑量組 8 43.75±6.71## 45.70±9.00##覆盆子低劑量組 8 34.48±7.26 35.49±6.37藥物對照組 8 38.25±10.13# 39.69±8.99#

2.2 海馬中NE的含量

結(jié)果顯示（圖1）：與空白對照組相比，尼古丁成癮大鼠海馬中去甲腎上腺素的含量顯著升高（P＜0.01），與模型對照組相比，覆盆子高劑量組、覆盆子低劑量組可降低海馬中去甲腎上腺素含量（P＜0.05），藥物對照組效果更顯著（P＜0.01）。

3 討論

許多研究表明，在EPM測試中上癮的物質(zhì)包括尼古丁和乙醇，在戒斷期間可產(chǎn)生嚴(yán)重的焦慮樣行為。自發(fā)活動的增加就是一個重要的行為學(xué)指標(biāo)，暗示嚙齒類動物的焦慮樣行為[14]。本實驗結(jié)果表明，尼古丁戒斷大鼠可表現(xiàn)出焦慮，其在開放臂停留的時間與空白組相比較短，進(jìn)入開放臂次數(shù)也相對減少。目前，藥物治療是抗焦慮的最直接治療方法[15]，代表藥物地西泮臨床應(yīng)用較為廣泛，本實驗也觀察到地西泮可明顯減輕焦慮行為，然而，眾所周知的苯二氮類藥物具有很大的局限，近來中草藥在治療情緒障礙如抑郁癥和焦慮變得更受歡迎了。據(jù)報道，在迷宮實驗中酸棗仁可大大改善小鼠的焦慮行為[16]。在目前的研究中，200 mg/kg的覆盆子提取物可明顯改善尼古丁戒斷期間大鼠的焦慮行為，而低劑量覆盆子提取物作用效果不太明顯，說明覆盆子提取物對焦慮樣行為的作用效果與給藥劑量存在一定關(guān)系。

圖1 覆盆子對尼古丁戒斷大鼠海馬NE含量的影響Fig.1 Effect of Raspberry on NE Content in H ippocam pus of Rats w ith Nicotine Withdrawal

尼古丁可增強膽堿能系統(tǒng)的活性，破壞腦細(xì)胞增殖與分化之間的協(xié)調(diào)性，使細(xì)胞由分裂增殖轉(zhuǎn)向分化。尼古丁可增強血清素類遞質(zhì)系統(tǒng)如多巴胺（dopamine，DA）、去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）、5-羥色胺（5hydroxy tryptamine，5-HT）等的合成、釋放和代謝活性[17-18]，這可能與興奮性神經(jīng)精神癥狀的產(chǎn)生有關(guān)。許多中樞神經(jīng)遞質(zhì)都參與尼古丁成癮的形成過程，主要包括 DA、阿片肽（opioid peptides，OP）、谷氨酸（glutamate，Glu）、乙酰膽堿（acetylcholine，Ach）、5-HT、NE。尼古丁可直接刺激 NE能神經(jīng)末梢，還可通過誘導(dǎo) γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）的釋放進(jìn)一步刺激NE的分泌。

本實驗條件下觀察到高、低劑量的覆盆子均有降低大鼠海馬內(nèi)NE的趨勢，提示降低海馬中NE的釋放，可能是覆盆子抗尼古丁戒斷焦慮作用的重要環(huán)節(jié)之一。本研究結(jié)果顯示：與空白對照組比較，模型組大鼠海馬中NE含量明顯升高，表明焦慮產(chǎn)生時腦內(nèi)NE釋放增加；與模型組相比較，經(jīng)治療后對照組、覆盆子組大鼠海馬中NE含量均降低，表明覆盆子對大鼠海馬組織的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)有降低作用，其抗焦慮癥的作用機制可能與降低腦內(nèi)海馬組織中NE的釋放有關(guān)。

綜上所述，本實驗探究覆盆子對尼古丁戒斷期間焦慮樣行為和海馬中NE水平的作用。覆盆子治療可緩解焦慮樣行為，改善由尼古丁戒斷引起的海馬中NE含量的增加。這些結(jié)果表明，覆盆子通過海馬中的去甲腎上腺素能使神經(jīng)系統(tǒng)恢復(fù)正常來治療嚙齒類動物尼古丁戒斷期間的焦慮樣行為，進(jìn)一步為覆盆子治療尼古丁戒斷提供了重要的依據(jù)。