列當(dāng)中Crenatoside神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制研究

韓雪峰,苗鑫，劉丹丹，張曉菲，邢海燕，李剛*

(1.內(nèi)蒙古人民醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110； 2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110)

列當(dāng)(OrobanchecaerulescensSteph)為列當(dāng)科列當(dāng)屬藥用植物，主要分布于黑龍江、甘肅、遼寧、內(nèi)蒙古、河北、山西、青海及新疆等省區(qū)[1]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究表明苯乙醇苷類化合為是其特征性化學(xué)成分，具有抗菌消炎、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)保護(hù)、肝臟保護(hù)、改善心血管系統(tǒng)等多種藥理作用。王曉琴等[2]發(fā)現(xiàn)毛蕊花糖苷和Crenatoside(OC4)是列當(dāng)中含量最高的苯乙醇苷類化合物，關(guān)于毛蕊花糖苷藥理作用的研究很多，如毛蕊花糖苷有改善D-半乳糖致急性衰老小鼠腦損傷的作用[2]，而有關(guān)Crenatoside藥理活性的研究相對(duì)較少。

大量國(guó)內(nèi)外研究已證實(shí)，發(fā)生衰老的原因之一是細(xì)胞內(nèi)半乳糖的大量堆積，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、代謝功能紊亂，而細(xì)胞內(nèi)源源不斷的半乳糖是由細(xì)胞外D-半乳糖供給的[3]。目前，細(xì)胞水平的衰老模型有腫瘤壞死因子誘導(dǎo)法、體外傳代法、D-半乳糖誘導(dǎo)法等。王琳等研究發(fā)現(xiàn)體外原代心肌細(xì)胞在D-半乳糖誘導(dǎo)后有擬衰老作用[4]，陳微等研究發(fā)現(xiàn)，D-半乳糖可對(duì)PC12細(xì)胞造成氧化損傷[5]，為本實(shí)驗(yàn)造模提供了理論依據(jù)。環(huán)磷酸腺苷效應(yīng)原件結(jié)合蛋白CREB是一種參與多種信號(hào)通路的重要核蛋白，在長(zhǎng)期記憶形成過(guò)程中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，海兔、果蠅、大鼠和小鼠等動(dòng)物試驗(yàn)中已得到證實(shí)[6]。目前研究表明，CREB分子是多種蛋白激酶的磷酸化底物，它的活化形式p-CREB可誘導(dǎo)下游基因BDNF等細(xì)胞因子表達(dá)或數(shù)目增加，從而影響學(xué)習(xí)記憶功能[7-8]。環(huán)腺苷酸cAMP是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，它在細(xì)胞內(nèi)的濃度直接影響下游蛋白激酶A(PKA)的活性，只有活化的PKA可進(jìn)入核內(nèi)參與多種轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化，其轉(zhuǎn)錄因子之一就是cAMP反應(yīng)原件結(jié)合蛋白CREB。自由基是機(jī)體正常的代謝產(chǎn)物，它的產(chǎn)生和消除在正常情況下是處于動(dòng)態(tài)平衡的，一旦打破，就會(huì)影響正常代謝[9]，加速機(jī)體衰老過(guò)程。氧自由基又稱活性氧，能消滅細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸而產(chǎn)生促進(jìn)機(jī)體衰老的過(guò)氧化物，MDA是氧自由基與生物膜多聚不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物，它的濃度間接反應(yīng)氧自由基的含量，是反應(yīng)細(xì)胞損傷程度的常用指標(biāo)?？寡趸窼OD是體內(nèi)主要的自由基清除酶，能清除陰離子自由基繼而保護(hù)細(xì)胞免受損傷，維持機(jī)體氧化與抗氧化平衡，是反應(yīng)機(jī)體內(nèi)源性抗氧化能力的常用指標(biāo)。LDH和SOD同樣均屬于氧化還原酶類，研究發(fā)現(xiàn)，列當(dāng)中苯乙醇苷類降低D-半乳糖造模后小鼠學(xué)習(xí)和記憶的錯(cuò)誤次數(shù)、縮短學(xué)習(xí)反應(yīng)期以及延長(zhǎng)記憶潛伏期，主要與影響腦組織SOD的活性、MDA、LF含量,使海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞核圓,細(xì)胞器增多,染色質(zhì)分布均勻，改變D-半乳糖腦化模型小鼠海馬超微結(jié)構(gòu)有關(guān)[10]。

基于這一現(xiàn)狀本課題組前期展開了對(duì)OC4可改善D-半乳糖致衰老模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的行為學(xué)研究，并進(jìn)一步探討其對(duì)D-半乳糖所致衰老小鼠腦組織SOD活性、MDA含量影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，OC4能夠降低腦組織神經(jīng)元損傷，可能與激活cAMP/PKA/CREB信號(hào)通路有關(guān)，以達(dá)到抗衰老，進(jìn)而改善學(xué)習(xí)記憶障礙的作用。因此，本課題組著手從cAMP/PKA/CREB信號(hào)通路的方向，以PC12神經(jīng)細(xì)胞為研究對(duì)象，展開對(duì)列當(dāng)中Crenatoside抗衰老作用的分子機(jī)制研究。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞

PC12細(xì)胞株(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)藥物研究所陳乃宏教授提供)是大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤分化細(xì)胞株，具有神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的一般特征。

1.2 主要儀器

超凈工作臺(tái)(DPC 450C，LEICA公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(HERA cell 150i CO2 incubator,Thermo 公司)；倒置顯微鏡(SN-CJ-αFD，Leica)；低溫高速離心機(jī)(Sigma 3-18K,德國(guó))；酶標(biāo)儀(Bio-RAD Model 1680,日本)；電泳儀(DYCZ-400,北京市六一儀器廠)；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(EPS-100，上海天能科學(xué)儀器公司)；旋渦混合器(wH-1,上海滬西分析儀器廠)，恒溫水浴鍋(HH-6，國(guó)華電器有限公司)；精密電子天平(UF3410，梅特勒-托利多儀器上海有限公司)

1.3 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基(Gbico)；FBS(Gbico)；MTT(Sigma)；大鼠BDNF酶聯(lián)免疫試劑盒(武漢新啟迪生物科技有限公司)；大鼠PKA酶聯(lián)免疫試劑盒(武漢新啟迪生物科技有限公司)；大鼠cAMP酶聯(lián)免疫試劑盒(武漢新啟迪生物科技有限公司)；D-半乳糖(Sigma)；Anti-CREB antibody ab32096(Abcam)；彩色預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(Sigma)；ECL顯色液(TheromoFisher Scientific)；羊抗兔二抗(KPL)；蛋白磷酸酶抑制劑混合物(康為世紀(jì)生物科技有限公司)；肉蓯蓉Crenatoside(王曉琴博士實(shí)驗(yàn)室自制，純度>95%)。

1.4 主要溶液及配制

1.4.1 細(xì)胞用溶液

生長(zhǎng)培養(yǎng)基： DMEM培養(yǎng)基，加入含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清，5%馬血清，0.6 ng/單位NGF，100/UmL青霉素和鏈霉素。MTT(5 g/L)：稱取0.1 g MTT粉末，溶于20 mL PBS緩沖液中，微孔濾膜過(guò)濾后,1 mL/vial分裝為20vials，置于-20℃避光儲(chǔ)存。D-gal:取0.16 g的D-gal加入10 mL的完全培養(yǎng)基中，混勻。終濃度16 g/L，現(xiàn)配現(xiàn)用。列當(dāng)OC4：取0.001 g OC4，加入1 mL去離子水，配成1 mL原液，微孔濾膜過(guò)濾后，4℃保存。使用時(shí)用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。磷酸鹽緩沖液(PBS)：高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 Western blot用溶液

按照文獻(xiàn)配制所需溶液[11]。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

PC12細(xì)胞株培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)為10%的類胎牛血清，5%馬血清)，于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～4 d，用吹打管吹打細(xì)胞，進(jìn)行1:3傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率并提供劑量選擇的依據(jù)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，吹打混懸后調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，以200 μL/孔接種于96孔板，37℃，5%的CO2孵箱中培養(yǎng)。48 h后取出吸棄舊培養(yǎng)基，正常對(duì)照組為200 μL的新鮮培養(yǎng)基，D-gal模型組為200 μL含有D-gal的培養(yǎng)基，使其終濃度為16 g/L，濃度6個(gè)復(fù)孔,造模組作用時(shí)間40 h。給藥組為200 μL含有OC4的培養(yǎng)基，使其終濃度分別為50 μg/mL和100 μg/mL，給藥時(shí)間24 h，每孔加5 mg/mL的MTT 20 μL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，后棄培養(yǎng)液，逐孔吸去液體后加DMSO l50 μL/孔，輕輕振蕩10 min，用酶標(biāo)儀在490 nm處讀取吸光度(A490)值，取5孔均值按下列公式計(jì)算，細(xì)胞存活率(%) =實(shí)驗(yàn)組A490/對(duì)照組A490×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)做統(tǒng)計(jì)分析。

2.3 雙抗體夾心法測(cè)定cAMP、PKA和BDNF

2.3.1 待測(cè)樣品的制備

藥物處理后，收集PC12細(xì)胞培養(yǎng)液，2 500 rpm離心10 min，取上清測(cè)試。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

標(biāo)準(zhǔn)品:加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1.0 mL至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，靜置10 min，待其充分溶解后，輕輕混勻(濃度為10 ng/mL)，之后在管身標(biāo)注①，然后根據(jù)需要進(jìn)行稀釋。保證凍干標(biāo)準(zhǔn)品徹底溶解和混勻。標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法取7支潔凈的試劑管，每管加入300 μL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。從第一管內(nèi)取出300 μL加入到第二管，混勻后，再?gòu)牡诙苋〕?00 μL加入到第三管，以此類推至第七管第八管為標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，作為陰性對(duì)照使用。

2.4 Western bloting

2.4.1 蛋白樣品的制備

藥物作用結(jié)束以后收集細(xì)胞沉淀于1.5 mL EP管中，按1×107·200 μL-1的比例加入裂解液RIPA緩沖液，冰上裂解5 min。4℃ 12 000 r/min離心5 min，收集上清液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.2 蛋白濃度的測(cè)定

按照蛋白濃度測(cè)定試劑盒配制A液和B液的混合液(發(fā)光液)，36孔板中加入不同濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品及發(fā)光液，酶標(biāo)儀于595 nm處測(cè)量吸光度，每個(gè)樣品管設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)曲線方程y=0.109 0x+0.048 3計(jì)算各組樣品的蛋白含量。蛋白質(zhì)定量以后，以還原型5XSDS上樣緩沖液混合調(diào)整蛋白終濃度至2 μg/μL，并于沸水中煮沸5 min變性，變性的蛋白質(zhì)樣品-80℃保存。

2.4.3 SDS-PAGE電泳

根據(jù)說(shuō)明書安裝玻璃板。將現(xiàn)配好的分離膠迅速向兩玻璃板的縫隙中灌注，加入去離子水封膠，靜置30 min，待聚合完全后，傾出上層水。將濃縮膠直接灌注約3 mL在分離膠上，立即在濃縮膠上方插入Teflon梳子，小心混入氣泡。濃縮膠聚合完全后，拔出梳子，最左邊孔道加入Macker，其他孔道加入樣品15μL。連接電泳裝置開始電泳，起始電壓100 V，當(dāng)染料前沿進(jìn)入分離膠后，電壓提高到120 V繼續(xù)電泳，直至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部。

2.4.4 轉(zhuǎn)膜

準(zhǔn)備6張3.0 cm×8.0 cm的濾紙和一張同樣大小的PVDF膜置于培養(yǎng)皿中，甲醇浸泡10 min。將夾子打開，依次放入海綿墊、3層濾紙、膠(根據(jù)Macker的位置切下分離膠，約為3 cm×8 cm)、PVDF膜、3層濾紙、海綿墊。最后合起夾子，輕輕置于轉(zhuǎn)移槽中，設(shè)置100 V轉(zhuǎn)移2 h。

2.4.5 封閉

將5%脫脂奶粉置于培養(yǎng)皿中，PVDF膜浸入此封閉液搖床上震蕩1 h。

2.4.6 抗體孵育

抗體CREB(1∶1 000)，P-CREB(1∶1 000)，β-actin(1∶1 500)分別用封閉液按比例稀釋后，4℃孵育過(guò)夜。TBST在室溫下脫色搖床上洗3次，每次10 min；再用TBS洗3次，每次10 min。二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h。TBST在室溫下脫色搖床上洗3次，每次10 min；再用TBS洗3次，每次10 min。

2.4.7 化學(xué)發(fā)光顯影

取ECL試劑盒中A、B兩種工作液各50 μL，將膜蛋白面朝上小心放到凝膠圖像成像系統(tǒng)，迅速將A、B兩液混合，均勻滴至膜上。選擇合適的曝光時(shí)間后，進(jìn)行拍照。

2.4.8 凝膠圖像分析

用Chemi Analysis凝膠蛋白分析軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析。

2.5 試劑盒檢測(cè)SOD、MDA和LDH

超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)試盒、細(xì)胞丙二醛(MDA)測(cè)試盒、乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)定試劑盒按照說(shuō)明書逐步操作。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 肉蓯蓉Crenatoside(OC4)對(duì)D-半乳糖所致PC12神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

D-半乳糖作用細(xì)胞40 h，細(xì)胞存活率已降低為(46.67±6.59)%，與空白組(85.52±6.18)%比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而OC4(50、100 μg/mL)對(duì)于D-半乳糖所致的存活率降低有明顯保護(hù)作用，并呈劑量依賴性(r=0.767,P<0.01)。但OC4大劑量升高細(xì)胞存活率的作用(68.21±6.89)%可被PKA抑制劑H-89顯著翻轉(zhuǎn)(53.21±6.21)%(P<0.05),結(jié)果見表1，提示肉蓯蓉OC4對(duì)于急性衰老模型的保護(hù)作用，有可能與cAMP/PKA/CREB信號(hào)通路有關(guān)。見表1。

3.2 OC4對(duì)造模后PC12神經(jīng)細(xì)胞中SOD、LDH活性和MDA含量的影響

結(jié)果顯示，空白組中SOD活性為(27.30±1.83)U/mL；LDH含量為(285.75±17.65)μmol/mL；MDA含量為(360.74±26.38)nmol/mgprot。模型組與空白組比較，SOD活性明顯下至(16.91±1.65)U/mL；LDH含量明顯上升至(360.34±16.87)μmol/mL；MDA含量明顯上升至(550.21±33.54)nmol/mgprot，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各給藥組與模型組比較，SOD活性均有所上升呈劑量依賴性(r=0.907,P<0.01)；LDH含量均有所下降有劑量依賴性(r=-0.927,P<0.05)；MDA含量均有所下降呈劑量依賴性(r=-0.850,P<0.05)。OC4大劑量組SOD活性均恢復(fù)至(28.34±1.86)U·mL-1(P<0.05)；LDH含量可恢復(fù)至(287.53±19.55)μmol·mL(P<0.05)；MDA含量可恢復(fù)至(389.62±38.62)nmol·mgprot-1(P<0.05)。H-89干預(yù)可翻轉(zhuǎn)OC4大劑量所致SOD活性升高(P<0.05)；LDH含量有所上升(P<0.05)；MDA含量有所上升(P<0.05)。結(jié)果見表2。

表1 OC4對(duì)于D-半乳糖干預(yù)后PC12細(xì)胞的細(xì)胞存活率的影響

注：與空白組比較，△P<0.05;與模型組比較，*P<0.05;與OC4大劑量組比較,★P<0.05

3.3 OC4對(duì)造模后PC12細(xì)胞中cAMP和PKA含量的影響

3.3.1 OC4對(duì)損傷的PC12細(xì)胞中cAMP含量的影響

結(jié)果顯示，空白組中cAMP含量為(8.080±0.349)ng·mL，模型組與空白組比較，cAMP含量明顯下至(4.017±0.286)ng·mL-1，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。給藥OC4組與模型組比較，cAMP含量均有所上升，且有劑量依賴性(r=0.895,P<0.05)，OC4大劑量組cAMP含量可恢復(fù)至(8.289±0.283)ng/mL(P<0.05)。OC4大劑量組經(jīng)過(guò)H-89干預(yù)后，cAMP含量有所下降，差異與給藥OC4大劑量組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

3.3.2 OC4對(duì)急性衰老細(xì)胞中PKA含量的影響

結(jié)果顯示，空白組中PKA含量為(8.420±0.126)ng/mL，模型組與空白組比較，PKA含量明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。給藥OC4組與模型組比較，PKA含量均有所上升，且有劑量依賴性(r=0.937,P<0.01)，OC4大劑量組PKA含量可恢復(fù)至(7.640±0.175)ng·mL(P<0.05)。OC4大劑量組經(jīng)過(guò)H-89干預(yù)后，PKA含量有所下降，差異與給藥OC4大劑量組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表2 OC4對(duì)造模后PC12細(xì)胞中SOD、MDA、LDH活性的影響

注：與空白組比較，△P<0.01;與模型組比較，**P<0.01;與給藥大劑量組比較,★P<0.05

表3 OC4對(duì)造模后的PC12細(xì)胞PKA及cAMP的影響

注：與空白組比較，△P<0.05;與模型組比較，**P<0.01;與OC4大劑量組比較，★P<0.05

3.4 OC4對(duì)PC12細(xì)胞p-CREB、CREB蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果顯示，模型組與空白組比較，D-半乳糖顯著抑制了p-CREB的入核作用(P<0.05)，給藥組與模型組比較，OC4顯著上調(diào)了D-半乳糖所致急性衰老模型中p-CREB的表達(dá)(P<0.05)，并且有劑量依賴性(r=0.903,P<0.01)。大劑量給藥組經(jīng)過(guò)H-89干預(yù)后，p-CREB的表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)。各組的CREB表達(dá)無(wú)明顯變化。見圖1、2。

3.5 OC4對(duì)造模后PC12細(xì)胞分泌的BDNF的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組與空白組對(duì)比，BDNF含量明顯下降至(0.710±0.026)ng/mL，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。給藥OC4組與模型組比較，BDNF含量明顯上升(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。OC4大劑量組經(jīng)阻斷劑H-89干預(yù)后，BDNF水平又明顯下降(P<0.05)，結(jié)果為為(0.756±0.038)ng/mL。見表4。

圖1 p-CREB、CREB表達(dá)結(jié)果

注:與空白組比較，*P<0.05;與模型組比較，#P<0.05;與OC4-100組比較,△P<0.05圖2 給藥OC4作用PC12細(xì)胞急性衰老模型后p-CREB、CREB的表達(dá)

組別劑量(μg/mL)BDNF(ng/mL)空白組—1.653±0.030模型組16×1030.710±0.026*OC4低劑量組501.835±0.033△OC4大劑量組1001.634±0.044△OC4+H89100+1000.756±0.038★

注：與正常組比較，△P<0.05;與模型組比較，*P<0.05;與OC4大劑量組比較,★P<0.05

4 討論

目前，關(guān)于列當(dāng)中苯乙醇苷類Crenatoside的研究主要集中在分離提取工藝及含量測(cè)定方面。王曉琴課題組前期建立了列當(dāng)中主要活性成分毛蕊花糖苷和crenatoside，以及總苯乙醇苷類化合物含量測(cè)定的方法,發(fā)現(xiàn)列當(dāng)中總苯乙醇苷含量在6.78%～27.43%，含量最高的成分是毛蕊花糖苷,其次為crenatoside 含量在0.83%～4.47%。同時(shí)發(fā)現(xiàn)藥材的采集時(shí)間對(duì)主要成分含量影響較大,盛花期采集的列當(dāng),苯乙醇苷類成分含量較高。但對(duì)于Crenatoside主要藥效及藥理學(xué)作用的研究目前相關(guān)鄰域研究較少，僅有的研究只有初步涉及到其列當(dāng)提取物苯乙醇總苷均具有較好的抗氧化能力,DPPH自由基清除試驗(yàn)顯示其清除DPPH自由基能力接近于抗壞血酸[12]；具有清除DPPH1-二苯基-2-三硝基苯肼的活性表現(xiàn)出顯著的抗菌活性[13-14]。本實(shí)驗(yàn)中，各組BDNF的變化與cAMP/PKA/CREB信號(hào)通路變化一致，提示OC4通過(guò)cAMP/PKA/CREB信號(hào)通路[15]影響B(tài)DNF的分泌并進(jìn)行探索實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明OC4對(duì)于D-半乳糖所致PC12神經(jīng)細(xì)胞損傷模型的cAMP/PKA/CREB信號(hào)通路水平有上調(diào)作用。D-半乳糖模型組cAMP和PKA水平降低，p-CREB表達(dá)減少，而各給藥組與模型組比較，cAMP/PKA/CREB信號(hào)通路水平上調(diào)，提示肉蓯Crenatoside改善D-半乳糖導(dǎo)致PC12細(xì)胞損傷的作用與調(diào)節(jié)cAMP/PKA/CREB信號(hào)通路水平有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)cAMP或鈣濃度的升高可以使CREB的Ser133位發(fā)生磷酸化作用而活化，p-CREB與真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)TATA框上游的cAMP反應(yīng)元件結(jié)合，啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄，影響蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，從而調(diào)節(jié)多種生物學(xué)功能，影響個(gè)體神經(jīng)元直至整個(gè)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的功能。

馬新良等[16]在對(duì)JNK信號(hào)通路的支架蛋白JIP3的研究中發(fā)現(xiàn)，BDNF除了可以促進(jìn)神經(jīng)元存活和分化、調(diào)節(jié)突觸可塑性外，BDNF/TrkB信號(hào)通路還可以通過(guò)激活CREB增加JIP3蛋白合成,促進(jìn)長(zhǎng)時(shí)的神經(jīng)遞質(zhì)釋放從而達(dá)到改善學(xué)習(xí)記憶功能的作用。此外，還有研究認(rèn)為海馬區(qū)突觸前膜蛋白SD蛋白、Syntaxin蛋白以及SNAP蛋白的表達(dá)水平影響Glu和GABA等與記憶相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)釋放[17]，這些都為今后例如阿爾茲海默癥，帕金森等相關(guān)疾病的研究提供必要的線索，同時(shí)也為我們下一步的研究工作奠定了基礎(chǔ)。