臍血間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)細胞誘導分化的研究進展

陳俊，楊自金

(徐州醫(yī)科大學附屬連云港醫(yī)院兒內(nèi)科，江蘇 連云港 222002)

人臍血間充質(zhì)干細胞(MSC)是存在于人臍帶血中的一種成體干細胞，具有旺盛的自我更新能力以及向多胚層分化的潛能[1]。在適宜的條件下，臍血MSC能分化為神經(jīng)元細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞，并且能夠分泌多種細胞活性因子，通過免疫調(diào)節(jié)、抑制炎癥、減少凋亡、細胞替代等機制實現(xiàn)對神經(jīng)系統(tǒng)功能的修復[2-3]。臍血MSC還具有免疫原性低、來源廣泛、倫理爭議少等優(yōu)點[4]，因此成為修復中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損的一種有前途且極具吸引力的種子細胞。

1 臍血MSC向神經(jīng)細胞誘導分化

1.1化學試劑誘導抗氧化劑作為最常見的化學誘導劑廣泛應用于干細胞研究中，早年研究使用的有β-琉基乙醇(βME)、二甲基亞砜(DMSO)、丁基羥基茴香醚(BHA)等。近年研究發(fā)現(xiàn)抗壞血酸(AsA)、維A酸(RA)、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)及腺苷酸環(huán)化酶激活劑毛喉素(Forskolin)也具有誘導分化作用。其中RA屬于維生素A的衍生物，Jin等[5]在使用不同濃度的全反式維甲酸(ATRA)對臍血MSC進行誘導時發(fā)現(xiàn)：ATRA既能夠誘導臍血MSC向神經(jīng)細胞分化，同時也能驅(qū)使細胞凋亡，這兩種不同機制具有劑量依賴性，當劑量為0.5 μmol時細胞分化效果最佳且凋亡最少。另外，IBMX和Forskolin能夠提高細胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的水平從而激活cAMP依賴蛋白激酶(PKA)，最終效應也是增加細胞分化和誘發(fā)細胞凋亡。對此，Shahbazi等[6]首次嘗試使用IBMX和Forskolin作為誘導劑對臍血MSC進行誘導，并成功誘導出神經(jīng)細胞。在誘導8 h后通過免疫化學法檢測到神經(jīng)元表面特異標志物巢蛋白(nestin)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、微管相關蛋白2(MAP2)以及星形膠質(zhì)細胞活化標志物膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)均陽性表達。

由于化學試劑存在細胞毒性作用，如RA長時間以來被公認為是一種致畸劑[7]，且在大劑量時能夠促進細胞凋亡，因此這些化學試劑的誘導機制以及安全誘導劑量還需深入研究。

1.2細胞因子誘導目前可作為誘導劑的已知細胞因子包括表皮生長因子 (EGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)生長因子(NGF)、胰島素樣生長因子(IGF)等。其中，EGF和bFGF是兩種廣譜的神經(jīng)營養(yǎng)因子，常作為預誘導劑提高誘導效率[8]。BDNF則廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，通過與特異性受體 TrkB結(jié)合激活細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶信號通路從而發(fā)揮生物學效應[9]，其誘導效果已被廣泛認可。新發(fā)現(xiàn)具有誘導作用的IGF是一類多功能細胞增殖調(diào)控因子，Hussain、Waheed等[10]使用IGF-1誘導臍血MSC，成功誘導出nestin標記陽性的神經(jīng)樣細胞。

近年研究發(fā)現(xiàn)，多種細胞因子聯(lián)合誘導或細胞因子聯(lián)合化學試劑誘導的方法能夠有效提高誘導效率，可以彌補單個細胞因子誘導效率較低的缺點，因此成為目前的研究熱點。Salehinejad等[11]使用細胞因子EGF、bFGF以及化學試劑RA、DMSO進行聯(lián)合誘導，誘導后的臍血MSC向神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞分化，通過檢測對比神經(jīng)細胞標志物nestin和GFAP的表達水平發(fā)現(xiàn)聯(lián)合誘導組的誘導效率明顯高于單獨誘導組。Rafieemehr等[12]則在上述研究的基礎上進一步提出了兩步誘導法：先將RA、EGF、bFGF作為預誘導劑誘導2 d，棄去預誘導劑后加入NGF、IBMX、AsA正式誘導6 d，誘導后細胞通過反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測到神經(jīng)細胞標志物MAP2、髓鞘堿性蛋白(MBP)和GFAP均高表達，成功誘導出神經(jīng)細胞并且誘導效率明顯提高，并認為RA相比其他誘導劑在促進細胞分化的過程中起到了更為關鍵的作用。

細胞因子與化學試劑相比，誘導后的細胞具有存活率高、毒副作用小，誘導效率較低的缺點，但可以通過聯(lián)合誘導的方案解決，因此應用前景更加廣泛。

1.3移植、共培養(yǎng)誘導通過將臍血MSC移植入宿主神經(jīng)組織，或與神經(jīng)組織細胞體外共培養(yǎng)，觀察移植或共培養(yǎng)后臍血MSC的發(fā)育、分化及作用情況。目前主要的細胞移植方法有：(1)側(cè)腦室注射移植法:經(jīng)立體定位儀定位后，通過側(cè)腦室穿刺將細胞注射入側(cè)腦室，使其隨腦脊液到達病變部位；(2)直接移植法:通過手術或其他技術手段將細胞直接移植于病變部位；(3)椎管內(nèi)植入法:將細胞通過腰椎穿刺術注射入蛛網(wǎng)膜下腔，使其隨腦脊液到達病變部位；(4)靜脈注射移植法:將細胞通過靜脈輸入，使其通過血腦屏障到達病變部位。Cui等[13]將臍血MSC直接移植到脊髓損傷大鼠的神經(jīng)受損部位，移植4周后行免疫組織化學法檢測，發(fā)現(xiàn)移植到受損部位的細胞陽性表達神經(jīng)元特異標志物NSE和膠質(zhì)細胞標志物GFAP，同時大鼠脊髓損傷模型的后肢運動功能評分也較損傷前提高，說明臍血MSC移植后能夠分化為神經(jīng)細胞并對損傷神經(jīng)組織進行修復。Miao等[14]通過腰椎穿刺鞘內(nèi)注射臍血MSC的方法，對接受注射的100名神經(jīng)系統(tǒng)損傷患者進行治療隨訪，結(jié)果表明此方法對于脊髓損傷、腦癱、腦梗死、腦外傷綜合征等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的恢復均具有一定的療效，其作用機制可能與上述實驗相同，即臍血MSC移植到體內(nèi)后能夠在神經(jīng)受損部位聚集并進行修復有關。類似于移植誘導法，共培養(yǎng)誘導法是在體外利用神經(jīng)組織細胞提供的生長環(huán)境來培養(yǎng)并促進細胞的分化。Zeng等[15]使用嗅鞘細胞條件培養(yǎng)液對臍血MSC進行共培養(yǎng)誘導，經(jīng)共培養(yǎng)后的細胞神經(jīng)元特異性標志物NSE陽性表達，并成功檢測到神經(jīng)電生理活動。上述研究表明，神經(jīng)組織細胞在生長過程中提供的微環(huán)境對臍血MSC分化為神經(jīng)細胞具有誘導促進作用，其原理可能與微環(huán)境中存在能夠誘導臍血MSC分化的神經(jīng)營養(yǎng)因子有關，這為細胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的開展提供了理論和實驗依據(jù)。

1.4基因轉(zhuǎn)染誘導基因轉(zhuǎn)染是將某些細胞因子質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到臍血MSC中后，通過不斷分泌這種具有誘導分化作用的細胞因子，以實現(xiàn)自我誘導。由于BDNF具有促進受損神經(jīng)元再生的作用，并且能夠誘導臍血MSC分化為神經(jīng)細胞。Hei等[16]利用腺病毒載體將BDNF轉(zhuǎn)染入臍血MSC，然后將轉(zhuǎn)染后的臍血MSC移植到坐骨神經(jīng)損傷大鼠模型中，4周后通過酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)和熒光實時定量反轉(zhuǎn)錄-聚合本群酶鏈反應(RT-qPCR)檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染組BDNF蛋白以及mRNA的表達水平均明顯升高。另外通過軸突計數(shù)、軸突密度測定和坐骨神經(jīng)功能檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染組神經(jīng)損傷部位的再生程度明顯高于其他實驗組，這些結(jié)果表明經(jīng)BDNF轉(zhuǎn)染后的臍血MSC能夠不斷分泌BDNF，以提高損傷局部BDNF濃度并且成功自誘導分化為神經(jīng)細胞，最終達到修復神經(jīng)損傷的目的。

臍血MSC的生存壽命有限，對生存環(huán)境要求較高，阻礙了其在臨床上的應用，端粒反轉(zhuǎn)錄酶(TERT)是端粒酶活性調(diào)節(jié)的關鍵因子，能夠促進缺血缺氧狀態(tài)下細胞的增殖和存活[17]，新生兒缺氧缺血性腦病(HIE)是圍產(chǎn)期窒息引起腦組織缺血缺氧導致的腦損傷性疾病，如果使用TERT和BDNF基因共修飾臍血MSC，就能在提高臍血MSC生存率的同時對受損神經(jīng)進行修復，可能成為治療HIE的一種新方法[18]。

雖然基因轉(zhuǎn)染法能夠在不使用誘導劑的情況下實現(xiàn)細胞的自誘導，但也存在轉(zhuǎn)染效率低、轉(zhuǎn)染后細胞生長狀態(tài)差甚至死亡的可能，限制了其臨床應用。

1.5中藥誘導中藥注射液如丹參、香丹、黃芩苷等能夠誘導臍血MSC向神經(jīng)細胞分化。Nan等[19]近來發(fā)現(xiàn)川芎嗪也具備誘導臍帶MSC分化為神經(jīng)細胞的能力，這些研究引發(fā)了廣泛地關注及后續(xù)研究。有研究者通過設置不同類型的誘導組合對臍血MSC進行誘導[20]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)丹參素+生長因子誘導組(丹參素+EGF+bFGF)的誘導效果要優(yōu)于單純細胞因子誘導組(EGF+bFGF)、單純化學試劑誘導組(βME+DMSO+BHA)以及化學試劑+細胞因子誘導組(RA+EGF/ BDNF+bFGF)，展示了中藥聯(lián)合細胞因子誘導的高效性及今后臨床應用的可行性。

中藥誘導劑價格便宜，毒副作用較小，在治療方法上可選擇口服或靜脈注射，也可用于臍血MSC移植后的體內(nèi)誘導分化，臨床應用方便。但中藥誘導劑的有效成分暫不十分明確，且存在純度不均一的問題。此外，為了更好、更安全地應用于臨床治療，其誘導分化的具體作用機制以及用量問題尚需進一步研究。

2 應用與展望

臍血MSC相比早前研究使用的神經(jīng)干細胞，具有取材方便、低免疫原性、無倫理爭議等優(yōu)點，是細胞移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的新型種子細胞。眾多動物實驗及臨床前期研究表明，臍血MSC作為新型種子細胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的優(yōu)勢明顯，可用于下列多種疾病的治療：(1)脊髓損傷性疾病，脊髓損傷后主要導致機體運動功能障礙，嚴重影響患者今后生存質(zhì)量，目前藥物治療更多只是延緩損傷進展，修復作用有限，而臍血MSC通過移植入脊髓受損部位后能夠促進神經(jīng)元軸突的再生與存活[21]，并聯(lián)合細胞替代作用實現(xiàn)對神經(jīng)功能的恢復，另有研究表明在脊髓損傷急性期移植臍血MSC對神經(jīng)功能的恢復更加有利[22]；(2)神經(jīng)退行性疾病，包括帕金森和阿爾茨海默病等，主要是由神經(jīng)元丟失、氧化應激和神經(jīng)炎癥反應所致[23-24]，目前可用于治療的藥物少且療效有限，而臍血MSC具有細胞替代以及減少氧化應激的作用[25]，能夠有效解決這些問題，成為治療神經(jīng)退行性疾病的新方法；(3)小兒腦性癱瘓，它是一種嚴重阻礙患兒智能和運動發(fā)育的疾病，給家庭帶來了沉重的經(jīng)濟負擔，目前治療主要是依靠康復訓練來改善癥狀，耗費人力物力財力，而臍血MSC移植療法則具有花費低、效果顯著的優(yōu)點[26]，是目前腦癱治療的研究熱點；(4)腦卒中，包括出血性腦卒中和缺血性腦卒中，以后者為主，已成為我國第一位死亡原因，且致殘率極高，目前藥物治療大多僅起到預防保護作用，而臍血MSC在移植后能夠向腦受損部位遷移，通過促進血管再生改善缺血損傷部位的血流量[27]，以減少梗死面積，并通過細胞替代修復受損神經(jīng)，修復效果可靠。除上述疾病外，臍血MSC還可用于缺血缺氧性腦損傷、脊髓側(cè)索硬化癥、腦白質(zhì)營養(yǎng)不良等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療，應用前景廣泛。

雖然臍血MSC的應用具有很多優(yōu)點，但仍存在以下問題：(1)體外培養(yǎng)問題，臨床應用需要大量細胞，如何保證細胞在體外培養(yǎng)條件下穩(wěn)定高效擴增，并避免在高速擴增過程中細胞出現(xiàn)轉(zhuǎn)化；(2)長期傳代培養(yǎng)問題，臍血MSC的多向分化潛能隨著培養(yǎng)時間的延長以及所傳代數(shù)的增多而降低[28]，另外長期傳代培養(yǎng)會增加細胞惡性轉(zhuǎn)換的概率，應注意實時監(jiān)測；(3)誘導分化問題，如何合理選擇誘導劑，如何安全高效誘導臍血MSC向神經(jīng)細胞分化，目前尚未有統(tǒng)一的意見和方法；(4)臨床應用安全性問題，雖有研究表明MSC體內(nèi)移植后的致瘤潛能很低[29]，但仍需謹慎，且在體內(nèi)移植之前需要對細胞進行嚴格測驗，如細胞活力以及內(nèi)毒素檢測，否則可能會出現(xiàn)嚴重不良后果。

綜上所述，雖然臍血MSC已被證明是一種非常有應用前景的種子細胞，但是在大量臨床應用之前，需要更深入的研究。相信隨著對臍血MSC研究的不斷深入，這些問題終會得到解決，屆時，臍血MSC將會產(chǎn)生巨大的社會效益和經(jīng)濟效益。