硒代氨基酸提取與檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

摘 要：硒元素人體健康有重要作用，硒代氨基酸具有很強(qiáng)的抗癌功效。介紹了水提取法、酸提取法、酶解法、輔助提取法和循環(huán)提取法等硒代氨基酸的提取方法，并對(duì)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、柱前衍生液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、電化學(xué)檢測(cè)法和氨基酸分析儀法等檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)的闡述，為生物體內(nèi)硒形態(tài)研究和有機(jī)硒定量分析提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)借鑒。

關(guān)鍵詞：硒代氨基酸；提取；檢測(cè)；綜述

中圖分類號(hào)：Q517 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-060X（2018）08-0123-05

Review on Extraction and Analysis Methods of Seleno Amino Acids

REN Jiang-zi1，ZHENG Ping1，WU Jing3，MAO Shu-xiang2，WANG Jun-wei2，

WU Qiu-yun2，XU Hao-ran2，HUANG Ke2

（1. Monitoring Center for the Quality and Safety on Agricultural Products of Liuyang， Hunan Liuyang 410300， PRC； 2. College of

Horticulture and Landscape， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， PRC； 3. Agricultural

Products Quality Monitoring Center of Changsha， Changsha 410003， PRC）

Abstract： Selenium plays an important role in human health， and seleno amino acids have a strong anti-cancer effect. the extraction and analysis methods of seleno amino acids were summarized， including water extraction， acid extraction， enzymatic hydrolysis， auxiliary extraction and recycling extraction. The methods of liquid chromatography-mass spectrometry， column derivative liquid chromatography， capillary electrophoresis， electrochemical detection and amino acid analyzer were systematically described. Those provide theoretical basis and technological reference for selenium form and quantitative analysis of organic selenium in organism.

Key words： seleno amino acids； extraction； analysis； review

硒（Se）是人體必需的微量元素，有研究表明，哺乳動(dòng)物體內(nèi)有10多種含硒酶，硒作為含硒酶的活性中心，對(duì)其生物活性起著至關(guān)重要的作用[1]，谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、氧硫還蛋白還原酶便屬于含硒酶[2]。GSH-Px利用谷胱甘肽GSH能將有毒的過氧化物還原為無害的羥基化合物，分解氧化物，清除自由基，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能，修復(fù)損傷部位。人體硒元素的缺乏，會(huì)引起免疫系統(tǒng)和認(rèn)知系統(tǒng)缺陷，甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)，引發(fā)心臟病、心血管疾病、退行性骨關(guān)節(jié)病等，甚至?xí)岣呋及╋L(fēng)險(xiǎn)[3]。

從代謝途徑上分類可將含有硒的蛋白質(zhì)劃分為硒蛋白和含硒蛋白。通過密碼子UGA編碼形成硒代半胱氨酸而進(jìn)入蛋白質(zhì)的蛋白為硒蛋白[4]，硒代半胱氨酸被認(rèn)為是第21種氨基酸，如谷胱甘肽過氧化物酶、硒蛋白P、I型碘甲狀腺素5’脫碘酶等；含硒蛋白則是硒代甲硫氨酸會(huì)取代蛋白質(zhì)中甲硫氨酸以含硒蛋白質(zhì)存在，該現(xiàn)象可能引起動(dòng)物和植物硒毒。硒代氨基酸還能甲基化，衍生成硒甲基硒代半胱氨酸[5]。硒代氨基酸由于手性中心造成其構(gòu)型不同，以致構(gòu)型不同的硒代氨基酸生物可利用性和生理活性有較大差異，一般來說L型的硒代氨基酸能被生物體利用，而D型或者消旋硒代氨基酸對(duì)生物體會(huì)產(chǎn)生危害[6]。

人體以食用含硒蔬菜而攝入獲取硒元素，但硒元素并不是植物生長(zhǎng)所必須，且硒元素取代植物中氨基酸的硫元素主要以硒代氨基酸和甲基硒代氨基酸存在，而我國(guó)一部分地區(qū)屬貧硒土壤，這增加了該地區(qū)居民罹患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)[7]。硒元素營(yíng)養(yǎng)逐漸受到人們的重視，一些能富集硒元素的植物被發(fā)現(xiàn)，人們也在蔬菜栽培過程中施以外源硒，以提高植物中有機(jī)硒含量，市場(chǎng)上富硒茶葉、富硒大米、富硒枸祀、富硒青花菜、富硒蘿卜等富硒食品應(yīng)運(yùn)而生。在蔬菜栽培過程中施硒，可提高缺硒地區(qū)居民的日常硒攝入量[8]。研究證明植物吸收硒元素之后，其抗氧化性能顯著提高[9]。

科學(xué)家對(duì)富硒青花菜進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)青花菜中有非蛋白的游離硒代氨基酸，比如：硒甲基硒代半胱氨酸、硒代半胱氨酸和γ-谷?；谆腚装彼醄10]。Davis等[11]發(fā)現(xiàn)，硒的抗癌功效取決于硒代氨基酸和甲基化的硒代氨基酸，青花菜中硒甲基硒代半胱氨酸具有極強(qiáng)的抗癌活性，該結(jié)果與Finley[12]的試驗(yàn)結(jié)果一致。利用生物強(qiáng)化法培養(yǎng)的富硒酵母含有較高有機(jī)硒，其被作為理想的硒源被添加進(jìn)飼料中。硒元素對(duì)生物體的健康作用，取決于其形態(tài)，對(duì)硒代氨基酸的提取和檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行系統(tǒng)闡述，可為生物體內(nèi)硒形態(tài)研究和有機(jī)硒定量分析提供技術(shù)支持，對(duì)于了解硒在生物體內(nèi)代謝機(jī)理及合理利用硒源有重要意義。

1 硒代氨基酸的提取方法

1.1 水提取法

硒代氨基酸主要以游離氨基酸和結(jié)合蛋白形式存在于生物體內(nèi)，水提取法主要提取試樣中的游離硒代氨基酸。潘紅陽等[13]在樣品中加入純水后，于50℃水

浴中提取硒代氨基酸，同時(shí)他們還探究了0.1 mol/L HCl

作為提取液和超聲波輔助提取條件下的提取效率，發(fā)現(xiàn)0.1 mol/L HCl提取富硒脫水菜心中的硒代氨基酸，輔助以超聲波提取8 h，可達(dá)到最佳的提取效果，且在硒代氨基酸在酸性條件下，利用高效液相柱前衍生法，比在純水條件下能獲得更低的檢出限。董亞蕾等[14]則是將固體樣品（茶葉、酵母、麥芽）和液體樣品（口服液）用90～95℃熱水浸提，渦旋30 s，超聲30 min，10 000 r/min離心獲得上清液為硒代氨基酸溶液。

1.2 酸提取法

根據(jù)目的氨基酸來源不同，在氨基酸提取過程中，采用稀酸提取或濃酸水解兩種方法。在茶葉氨基酸含量的研究中，主要關(guān)注于茶葉浸提液中的氨基酸含量，秦冰等[15]為探究外源硒肥對(duì)茶樹葉中硒代氨基酸形態(tài)及含量的影響，采用稀酸浸提茶葉中的硒代氨基酸，輔助以超聲波，提取方法為：液氮研磨樣品后用10 mL 0.1 mol/L HCl浸泡并用超聲波震蕩提取10 min，低速離心獲得上清液，將剩余沉淀再次用0.1 mol/L HCl浸泡并超聲2次，離心后獲得上清液，合并定容于25 mL 容量瓶，即為氨基酸提取溶液；檢測(cè)時(shí)，取氨基酸提取液2.5 mL于25 mL容量瓶用20 mg/L NaN3定容，搖勻溶液用0.22 μm濾膜過濾，進(jìn)樣。鐵梅等[16]等發(fā)現(xiàn)Tris-HCl緩沖液提取到富硒金針菇中可溶性含硒化合物主要以小分子狀態(tài)存在，需要利用4 mol/L HCl將大分子硒蛋白進(jìn)行酸水解反應(yīng)后，獲得了硒代甲硫氨酸和硒代半胱氨酸。而滕冰[17]等認(rèn)為，6 mol/L HCl能比4 mol/L HCl提取硒代甲硫氨酸得率提高34%。李紅衛(wèi)等[27]降低了6 mol/L HCl水解蛋白的溫度條件，發(fā)現(xiàn)，50℃條件下提取48 h所得的硒化合物含量高于110℃條件下提取24 h的量，該條件較溫和的酸水解法適用于富硒米曲霉中的硒代氨基酸的提取，減少了劇烈水解反應(yīng)對(duì)含硫氨基酸的破壞。

1.3 酶解法

蛋白形態(tài)分析普遍采用酸水解的前處理方法，非蛋白形態(tài)的游離氨基酸采用水浸提的前處理方法，由于硒在生物體內(nèi)結(jié)合態(tài)和游離態(tài)氨基酸都存在，且酸水解法是以打破蛋白中連接氨基酸之間的肽鍵，釋放氨基酸，酸解過程不可控制，蛋白可能被過分分解，使得硒代氨基酸結(jié)構(gòu)被破壞。蛋白質(zhì)水解酶能夠有效的斷開蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的肽鍵，硒代氨基酸不會(huì)被過分的破壞，具有專一性，提取效率高，是硒代氨基酸研究中常用的提取方法。但酶水解法有耗時(shí)長(zhǎng)，水解不一定充分的缺點(diǎn)。

李寶瑞[18]利用該法提取黃豆中硒代氨基酸，具體方法為：將研磨好的黃豆樣品加入到30 mmol/L Tris-

HCl（pH值7.5）中，于40℃浸提90 min，常溫低速離心取上清液，取上清液然后加入4倍體積丙酮于-20℃冰箱放置，4℃下高速離心棄上清吹干。將所得蛋白用5 mL Tris-HCl再次溶解，加入胰蛋白酶，50℃水浴振蕩后加入同蛋白酶K振蕩4 h，最后用100℃水浴滅酶，離心上清液即為硒代氨基酸溶液。Casiot等[19]研究酵母中硒形態(tài)發(fā)現(xiàn)，蛋白酶水解法，可以釋放出85%的硒代氨基酸，主要形態(tài)為硒代甲硫氨酸，用崩潰酶也可以分解硒蛋白中20%左右的硒代甲硫氨酸，該研究說明酶解法具有專一性。為使含硒蛋白充分水解為硒代氨基酸，謝倩等[20]將Tris-HCl

提取的樣品溶液，每隔12 h依次加入胰蛋白酶、蛋白酶K及鏈霉蛋白，在37℃下振蕩酶解，將分子量大于3 kD的物質(zhì)除去，獲得硒代氨基酸溶液，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該方法能使基線平穩(wěn)，硒代氨基酸得到較好分離。

1.4 輔助提取法

在硒代氨基酸的提取中，采用多種輔助手段可大大提高提取效率，這些輔助技術(shù)包括加熱、攪拌、微波和超聲波等。樣品對(duì)微波能的吸收，極大地加速了待測(cè)物分子與介質(zhì)分子之間的相互作用，提取效率可顯著提高。超聲波能使溶液中的固體與之充分混合，并發(fā)生物理或化學(xué)反應(yīng)，加速了固體樣品的預(yù)處理過程。輔助提取技術(shù)克服了常規(guī)分解技術(shù)耗時(shí)、低效、耗試劑及污染等缺點(diǎn)。

硒蛋白在酶水解過程中，其產(chǎn)物硒代氨基酸的形態(tài)不致被破壞，但耗時(shí)長(zhǎng)，可能在長(zhǎng)時(shí)間的酶解過程中導(dǎo)致硒形態(tài)發(fā)生氧化等轉(zhuǎn)變。Peachey等[21]利用微波輔助技術(shù)與酶解法結(jié)合提取富硒酵母中的硒代氨基酸，他對(duì)微波功率、提取溫度、時(shí)間等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，經(jīng)檢測(cè)結(jié)果表明，樣品回收率可達(dá)100.1%，且提取時(shí)間縮短至30 min。方勇[22]利用α-淀粉酶和蛋白酶ⅪⅤ順序酶解，輔助以超聲波技術(shù)，能將普通大米和富硒大米硒的提取率有效提高提高至90%左右。超聲波技術(shù)在酶解過程中能將植物細(xì)胞破碎，利于這兩種酶高效酶解，使細(xì)胞釋放出硒化合物，將酶解效率大大提高，同時(shí)縮短提取時(shí)間。采用超聲波探針輔助酶法提取富硒芥菜、富硒大蒜、富硒馬鈴薯、富硒酵母和雞組織硒代氨基酸，提取時(shí)間也可縮短至30 s到30 min[23-25]。

1.5 循序提取法

硒代氨基酸在生物體內(nèi)的存在形式非常復(fù)雜，為了更好地研究硒代氨基酸在生物內(nèi)的存在形式和含量，很多研究會(huì)通過多種提取方式順序進(jìn)行，再同時(shí)用酶進(jìn)行蛋白水解或順序水解，使得硒代氨基酸的提取效率達(dá)到最高。Mounicou等[26]利用循序提取法探究了大蒜中硒的存在形式，他們先用水提取大蒜中的硒化合物，然后依次加入混合裂解酶（纖維素酶、殼聚糖酶和β-葡聚糖酶）和蛋白酶ⅪⅤ，再用HCl和SDS提取，硒的回收率達(dá)了90%以上。

2 硒代氨基酸的檢測(cè)方法

2.1 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

高效液相色譜，近20 a來在物質(zhì)分離上被廣泛應(yīng)用，它分離能力強(qiáng)、靈敏度高、選擇性好、分析速度快，適合于分離樣品中非揮發(fā)的化學(xué)形態(tài)。HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)在蔬菜、蔥蒜、菌類、酵母、尿液和血漿等生物樣品中硒代氨基酸、多肽和蛋白研究中被廣泛應(yīng)用，且具有較低檢出限。

方勇[22]優(yōu)化RP-HPLC聯(lián)用ICPMS技術(shù)檢測(cè)硒化合物，發(fā)現(xiàn)6種硒化合物在12 min內(nèi)能完成基線分離，得到較好的分離效果，每種硒化合物標(biāo)樣的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸系數(shù)在0.99以上，同一樣品多次進(jìn)樣重復(fù)性好，回收率在90%左右，回收率較高，該方法的色譜條件使用色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為5%甲醇和0.015% HFBA溶液（pH值3.1），流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為50 μL；質(zhì)譜的RF功率為1 450 W，冷卻氣流為15.0 L/min，載氣流速為1.05 L/min，同位素檢測(cè)Se分子量為77、78、80、82，反應(yīng)氣體為3.5 mL/min氫氣，四級(jí)桿偏壓為-16.0 V，八級(jí)偏壓為-18.0 V，駐留時(shí)間為0.1 s。利用該方法檢測(cè)富硒大米，發(fā)現(xiàn)其硒代氨基酸的主要形態(tài)是硒代甲硫氨酸，且普通大米在噴施硒肥后，硒代甲硫氨酸的含量增加了60%左右。研究者還利用HPLC-ICPMS聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)對(duì)富硒酵母中的Se-Met的手性進(jìn)行探究，研究者使用微波輔助消化氫化物裝置以提高檢測(cè)靈敏度，測(cè)定出了Se-Met的D型和L型含量，但該聯(lián)用技術(shù)需要進(jìn)行柱前衍生，操作較繁瑣且氨基酸衍生后會(huì)產(chǎn)生副產(chǎn)品而影響ICP-MS檢測(cè)[6]。謝倩等[20]在前人基礎(chǔ)上優(yōu)化了反相離子對(duì)高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜（HPLC-ICP-MS）聯(lián)用技術(shù)，用5 mmol/L檸檬酸銨-2%的甲醇溶液作為流動(dòng)相，并用檸檬酸精準(zhǔn)調(diào)節(jié)pH值至4.9，無梯度洗脫，流速為1 mL/min，將硒蛋白中的硒代氨基酸成功分離。董亞蕾等[14]對(duì)超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用法的分離色譜柱、流動(dòng)相和質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)采用HSST3柱，0.1%甲酸水-乙腈為流動(dòng)相能較好分理處4種硒代氨基酸。

2.2 柱前衍生液相色譜法

高效液相色譜儀柱前衍生法檢測(cè)硒代氨基酸，解決了檢測(cè)過程中質(zhì)譜儀的限制，通過特定的衍生試劑對(duì)氨基酸進(jìn)行衍生化反應(yīng)，可以簡(jiǎn)便高效地完成硒代氨基酸的檢測(cè)。

潘紅陽等[13]采用反相高效液相色譜法測(cè)定了富硒脫水菜心中的硒代氨基酸。實(shí)驗(yàn)衍生試劑配置：將100mg OPA溶解于1 mL乙腈和130 μL 2-巰基乙醇中，再用濃0.4 mol/L硼酸緩沖溶液（pH值10.2）定容至

10 mL，混勻，冰箱中冷凍保存。流動(dòng)相A：27.6 mmol/L

醋酸鈉-三乙胺-四氫呋喃（體積比為500∶0.11∶25，

pH值7.2）；B：80.9 mmol/L醋酸鈉-甲醇-乙腈（體積比

為1∶2∶2，pH值7.2）。色譜柱為HP Hypersil ODS柱（125 mm×4.6 mm，5 μm），梯度洗脫，洗脫程序?yàn)椋? min，

8%B；17 min，50%B；20.1 min，100%B；24 min，0%B，流速10 mL/min。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)有3種硒代氨基酸能夠在20 min前被洗脫出，有良好的分離度，3種硒代氨基酸在其線性范圍內(nèi)峰面積與其濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（R>0.999），相對(duì)偏差RDS≤5%，平均回收率在95.7%～112.95%之間，該方法重現(xiàn)性較好，準(zhǔn)確率高、靈敏可靠的優(yōu)點(diǎn)。李紅衛(wèi)等[27]采用了4-氯-3，5-二硝基三氟甲苯作為柱前衍生劑，簡(jiǎn)化流動(dòng)相以乙腈-水（1∶1，V/V）和pH值6.8的乙酸-乙酸鈉緩沖液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，分析了富硒米曲霉中硒代氨基酸的含量且取得了良好的效果。

2.3 氣相色譜法

氣相色譜（GC）最廣泛地應(yīng)用于易揮發(fā)的硒化合物，其分離效果主要取決于化合物和所用固定相的極性。由于GC具有高分辨率和分離效率，GC-ICPMS聯(lián)用技術(shù)得到迅猛發(fā)展，該聯(lián)用技術(shù)能夠消除多干擾、簡(jiǎn)化分離步驟，提高分析準(zhǔn)確度。氣相色譜適用于揮發(fā)性含硒化合物檢測(cè)，該技術(shù)在檢測(cè)空氣、海水及含揮發(fā)性硒化合物的樣品中應(yīng)用較廣泛。

通過GC檢測(cè)的樣品為氣態(tài)，與ICPMS聯(lián)用能使樣品等離子體的傳輸效率接近100%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于HPLC-ICPMS效率，因此GC-ICPMS聯(lián)用可得到很好的檢出限。有研究者利用L-纈氨酸-t-丁基酰胺（商品名：Chirasil-L-Val）為手性柱，GC-ICPMS聯(lián)用拆分了酵母和人體血漿中的Se-D，L-甲硫氨酸，取得了很好的分離效果，且檢出限達(dá)到0.25 μg/L；但該方法中需對(duì)Se-D，L-甲硫氨酸進(jìn)行酯化?；苌屯ǖ醪僮?，較為繁瑣；食品添加劑和人尿中的Se-D，L-甲硫氨酸，GC-ICPMS聯(lián)用裝置獲得較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；與HPLC-ICPMS聯(lián)用裝置相比，GC與ICP-MS的接口設(shè)計(jì)要困難，且需對(duì)硒代氨基酸進(jìn)行衍生以改善選擇性能和提高待測(cè)物質(zhì)的揮發(fā)性[6]。農(nóng)晉琦[28]

將硒代半胱氨酸甲基化，然后使甲基硒代半胱氨酸與溴化氰（CNBr）發(fā)生專一反應(yīng)，氣相色譜法（GC）可測(cè)定生成的硒氰酸甲酯（CH3SeCN），以此來檢測(cè)樣品中硒代半胱氨酸的含量，該方法有89.5%的準(zhǔn)確度，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差在2.1左右，不受常規(guī)氨基酸的干擾，對(duì)測(cè)定含有微量硒代氨基酸的樣品較適用。

2.4 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳（Capillary Electrophoresis，CE）通過離子不同的電泳淌度將含硒化合物分離，物質(zhì)的離子淌度主要由其質(zhì)荷比、空間大小和其與緩沖組分的相互作用來決定。毛細(xì)管電泳具有分離效率高、耗樣量小、分離快等優(yōu)點(diǎn)，小分子、離子到生物大分子都可以得到分離，在硒的形態(tài)分析被廣泛應(yīng)用。Mounicou等[29]為研究富硒酵母中的含硒組分，先用SEC-HPLC進(jìn)行組分分離，然后利用CE-ICPMS分離出無機(jī)硒、硒代半胱氨酸、硒代甲硫氨酸等來分析富硒酵母的硒形態(tài)。還有研究者利用CE-ICPMS對(duì)硒化合物的手性進(jìn)行分析，優(yōu)化了一對(duì)手性硒代氨基酸的分離技術(shù)[30]。李平靜等利用毛細(xì)管電泳動(dòng)態(tài)pH界面堆積技術(shù)對(duì)幾種重要的中性硒代氨基酸進(jìn)行了在柱富集，聯(lián)用高靈敏的ICP-MS，實(shí)現(xiàn)了環(huán)境及生物樣品中極低含量硒代氨基酸的形態(tài)分析。目前CE-ICPMS聯(lián)用技術(shù)及其在硒形態(tài)分析的應(yīng)用正處于一個(gè)發(fā)展階段，研究高效、快速、集富集與分離于一體的，且不破壞硒形態(tài)及分布的試樣前處理技術(shù)，是CE-ICPMS聯(lián)用技術(shù)中急需解決的問題。

2.5 電化學(xué)檢測(cè)法

用電化學(xué)分析法測(cè)定硒含量，具有高靈敏度、分析速度快、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)。早在20世紀(jì)60年代末研究者就對(duì)于探討了硒代胱氨酸（SeC）和一些含硒有機(jī)化合物在汞電極上的還原特性和定量分析[31]。傳統(tǒng)的固體電極與汞電極相比，固體電極無法連續(xù)更新電極表面、表面狀況不規(guī)則等情況，使得檢測(cè)結(jié)果重現(xiàn)性差、靈敏度低且失去選擇性[32]。白燕等[33]利用硒代氨基酸的電化學(xué)特性，制備出對(duì)硒代胱氨酸（SeC）有較高靈敏度和較高選擇性的硒-金膜修飾玻碳電極[（Se-Au）G/C]。由于硒代半胱氨酸（SeCys）在活體外極易氧化為硒代胱氨酸（SeC），硒代甲硫氨酸（SeMet）沒有電化學(xué)活性，利用電化學(xué)檢測(cè)法很難檢測(cè)到SeCys和SeMet?，F(xiàn)在還集中于SeC的電化學(xué)還原特性研究來對(duì)硒代氨基酸進(jìn)行定量分析[31]。

李蕊[31]利用Ag/AgCl電極做參比電極、鉑絲電極做對(duì)電極，以硒-金膜修飾玻碳電極 [（Se-Au）G/C]為工作電極。在0.10 mol/L KNO3（pH值3.2）底液中，通氮?dú)獬鹾笤诘獨(dú)怙柡蜁r(shí)采用循環(huán)伏安法（CV）、旋轉(zhuǎn)圓盤電極法（RDE）和計(jì)時(shí)電量法（CC）研究SeC在[（Se-Au）G/C]上的電化學(xué)特性。確定SeC的化學(xué)特性后，再用微分脈沖伏安法（DPV）研究SeC峰電流（ip）與SeC濃度之間的線性遞增關(guān)系，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定了富硒酵母和富硒茶葉中SeC含量。該方法測(cè)定富硒酵母中SeC的含量的約為864.89 μg/g，相對(duì)偏差在9.14%，回收率為102%；富硒茶葉中測(cè)得0.64 μg/g含量的SeC，回收率在97%。該研究結(jié)果說明，在[（Se-Au）G/C]電極上用微分脈沖伏安法能夠簡(jiǎn)便、靈敏、穩(wěn)定、低毒地完成植物中SeC含量測(cè)定。

楊培慧等[34]采用循環(huán)伏安法（CV）研究硒代甲硫氨酸（SeMet）在銀電極表面的電化學(xué)行為，在0.03 mol/L的硼砂-NaOH（pH值9.5）介質(zhì)中，于+0.30V（vs.SCE）電位下進(jìn)行吸附，在-0.62 V和-0.68 V處獲得一對(duì)氧化還原峰，找到了SeMet在銀電極表面的電極反應(yīng)機(jī)理，建立SeMet的定量方法，該方法的最低檢出限為4.0×10-12mol/L，測(cè)定了谷物中SeMet含量的測(cè)定。秦冰等[15]利用離子色譜-積分脈沖安培聯(lián)用裝置（HPAEC-IPAD）對(duì)茶樹葉中硒代氨基酸性質(zhì)和含量進(jìn)行了分析，將高效色譜分離和積分脈沖安培檢測(cè)兩者結(jié)起來，在檢測(cè)茶葉中硒代氨基酸時(shí)無需進(jìn)行衍生反應(yīng)，且檢測(cè)過程中不受常規(guī)氨基酸雜峰干擾，是硒代氨基酸的理想檢測(cè)方法。

2.6 氨基酸分析儀法

氨基酸自動(dòng)分析儀法是現(xiàn)今常規(guī)氨基酸測(cè)定中常用的檢測(cè)方法。滕冰等[17]采用氨基酸自動(dòng)分析儀，優(yōu)化了硒代氨基酸的檢測(cè)方法，檢測(cè)到了富硒酵母的硒代甲硫氨酸和硒代胱氨酸，且縮短了檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)。郝素娥等在利用氨基酸分析儀檢測(cè)富硒酵母中的硒代甲硫氨酸和硒代胱氨酸時(shí)，發(fā)現(xiàn)普通的氨基酸分析方法不能是這兩種硒代氨基酸的基線分離，試驗(yàn)中降低檢測(cè)流速、采用長(zhǎng)柱，使得硒代甲硫氨酸和硒代胱氨酸的分離度達(dá)到了90%。

3 展 望

硒在生物體內(nèi)主要以有機(jī)硒的形式存在，除一些小分子硒代氨基酸以外，還包括硒蛋白、硒多糖等有機(jī)硒[22]，由于硒的存在形式復(fù)雜且不穩(wěn)定，在樣品處理過程中就要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟捎貌煌那疤幚矸椒?，以盡可能保持硒形態(tài)的原始特性，是準(zhǔn)確分析植物硒形態(tài)的關(guān)鍵[35]。水提取法和弱酸提取法主要適用于小分子硒代氨基酸的提取，而結(jié)合蛋白態(tài)里硒代氨基酸則要用濃酸提取法、酶解提取法、輔助提取法和循環(huán)提取法來提取，以保證氨基酸能充分釋放，且能保護(hù)硒代氨基酸的形態(tài)不被破壞[9]。科技發(fā)展使得人們對(duì)檢測(cè)儀器的精度、靈敏度、效率等要求越來越高，聯(lián)用技術(shù)被普遍應(yīng)用于化合物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中。硒代氨基酸的檢測(cè)中，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)、氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)、毛細(xì)管電泳與質(zhì)譜聯(lián)用，滿足了研究者在硒形態(tài)研究中的要求；還有研究者利用硒代氨基酸的電化學(xué)性質(zhì)，檢測(cè)其在富硒酵母中的含量；硒代氨基酸屬于氨基酸的一種，有人在常規(guī)氨基酸檢測(cè)的技術(shù)上進(jìn)行優(yōu)化，利用氨基酸檢測(cè)儀或柱前衍生高效液相色譜法檢測(cè)到了硒代氨基酸。硒代氨基酸的功能性越來越受到國(guó)內(nèi)外研究者的關(guān)注，本文綜述了近年來提取和檢測(cè)硒代氨基酸的一些方法，旨在為今后生物體內(nèi)硒形態(tài)研究和有機(jī)硒定量分析的研究提供可行的提取和檢測(cè)硒代氨基酸的方法，對(duì)硒在生物體內(nèi)代謝機(jī)理和合理利用硒源的研究提供技術(shù)支持。

參考文獻(xiàn)：

[1] Kvcala J. Selenium and the organism[J]. Casopís Lékar?? C?eskych，1999，138（4）：99-106.

[2] Birringer M，Pilawas S，F(xiàn)lohé L. Trends in selenium biochemistry[J]. Natural Product Reports，2002，19（6）：693-718.

[3] Rayman M P. Selenium and human health： The Lancet[J]. Lancet，2000，379（9822）：1256-1268.

[4] 徐輝碧. 硒的化學(xué)、生物化學(xué)及其在生命科學(xué)中的應(yīng)用[M]. 武漢：華中理工大學(xué)社出版社，1994.

[5] 張 明，杜業(yè)剛，林少彬，等. 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法定量檢測(cè)青花菜

中L-硒甲基硒代半胱氨酸 [J]. 分析化學(xué)，2007，35（2）：244-246.

[6] 黃曉佳，王秋泉，黃本立. 生物體系中硒代氨基酸的手性形態(tài)分析進(jìn)展[J]. 分析化學(xué)，2005，33（9）：1330-1334.

[7] 陳劍俠，楊伯忠，范麗華，等. 富硒葡萄中硒限量標(biāo)準(zhǔn)的研究[J]. 福建分析測(cè)試，2013，22（4）：31-33.

[8] White PJ. Biofortification of UK food crops with selenium[J]. Proceedings of the Nutrition Society，2006，65（2）：169-181.

[9] Pedrero Z，Madrid Y. Novel approaches for selenium speciation in foodstuffs and biological specimens： A review [J]. Analytica Chimica Acta，2009，634（2）：135-152.

[10] Lyi S M，Heller L I，Rutzke M，et al. Molecular and biochemical characterization of the selenocysteine Se-methyltransferase gene and Se-methylselenocysteine synthesis in broccoli[J]. Plant Physiology，2005，138（1）：409-420.

[11] Davis C D，Zeng H，F(xiàn)inley J W. Selenium-enriched broccoli decreases intestinal tumorigenesis in multiple intestinal neoplasia mice[J]. Journal of Nutrition，2002，132（2）：307-309.

[12] Finley J W. Reduction of cancer risk by consumption of selenium-enriched plants： enrichment of broccoli with selenium increases the anticarcinogenic properties of broccoli[J]. Journal of Medicinal Food，2003，6（1）：19.

[13] 潘紅陽，王樹英，莫海珍. 反相高效液相色譜法測(cè)定富硒脫水菜心中的硒代氨基酸[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34（10）：141-144.

[14] 董亞蕾，劉文婧，曹 進(jìn)，等. 超高效液相色譜-串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜法測(cè)定富硒食品中的硒代氨基酸[J]. 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2017，8（7）：2401-2406.

[15] 秦 冰，谷勛剛，王雅楠，等. 外源硒肥對(duì)茶樹葉中硒代氨基酸形態(tài)及含量影響的研究[J]. 土壤通報(bào)，2013，44（4）：956-963.

[16] 鐵 梅，方禹之，孫鐵彪，等. HPLC-ICP-MS聯(lián)用技術(shù)在富硒金針菇硒的形態(tài)分析中的應(yīng)用[J]. 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，2007，28（4）： 635-639.

[17] 滕 冰，郝素娥. 硒代氨基酸的分析[J]. 氨基酸和生物資源，1993，（1）：36-38.

[18] 李寶瑞. 黃豆富硒特性及硒的形態(tài)分布研究[D]. 遼寧：遼寧大學(xué)，2015.

[19] Casiot C，Szpunar J，Lobinski R，et al. Sample preparation and HPLC separation approaches to speciation analysis of selenium in yeast by ICP-MS[J]. Journal of Analytical Atomic Spectrometry，2017，14（4）：645-650.

[20] 謝 倩，史廷明，黃文耀，等. HPLC-ICP/MS測(cè)定硒蛋白中硒代氨基酸的方法[J]. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2015，（5）：4586-4587.

[21] Peachey E，Mccarthy N，Goenagainfante H. Acceleration of enzymatic hydrolysis of protein-bound selenium by focused microwave energy[J]. Journal of Analytical Atomic Spectrometry，2008，23（4）：487-492.

[22] 方 勇. 外源硒在水稻籽中的生物強(qiáng)化和化學(xué)形態(tài)研究[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[23] Capelo J L，Ximénezembún P，Madridalbarrán Y，et al. Enzymatic probe sonication： enhancement of protease-catalyzed hydrolysis of selenium bound to proteins in yeast[J]. Analytical Chemistry，2004，76（1）：233.

[24] Caba?ero A I，Madrid Y，Cámara C. Enzymatic probe sonication extraction of Se in animal-based food samples： a new perspective on sample preparation for total and Se speciation analysis[J]. Analytical Bioanalytical Chemistry，2005，381（2）：373-379.

[25] Cuderman P，Kreft I，Germ， M，et al. Selenium species in selenium-enriched and drought-exposed potatoes[J]. Journal of Agricultural Food Chemistry，2008，56（19）：9114-9120.

[26] Mounicou S，Dernovics M，Bierla K，et al. A sequential extraction procedure for an insight into selenium speciation in garlic[J]. Talanta，2009，77（5）：1877-1882.

[27] 李紅衛(wèi)，王開萍，吳 娛，等. 柱前衍生—反相高效液相色譜法檢

測(cè)富硒米曲霉中有機(jī)硒形態(tài)[J]. 食品科學(xué)，2015，36（22）：137-141.

[28] 農(nóng)晉琦，蔡端仁，歐陽政. 硒半胱氨酸和硒胱氨酸的間接氣相色譜測(cè)定—溴化氰—?dú)庀嗌V法[J]. 色譜，1994，（1）：28-31.

[29] Mounicou S，Mcsheehy S，Szpunar J，et al. Analysis of selenized yeast for selenium speciation by size-exclusion chromatography and capillary zone electrophoresis with inductively coupled plasma mass spectrometric detection （SEC-CZE-ICP-MS）[J]. Journal of Analytical Atomic Spectroscopy，2002，17（1）：15-20.

[30] Day J A，Kannamkumarath S S，Yanes E G，et al. Chiral speciation of Marfey’s derivatized DL-selenomethionine using capillary electrophoresis with UV and ICP-MS detection[J]. Journal of Analytical Atomic Spectroscopy，2002，17（1）：27-31.

[31] 李 蕊. 含硒氨基酸的電化學(xué)特性研究及其應(yīng)用[D]. 廣州：暨南大學(xué)，2004.

[32] 高小霞. 電分析化學(xué)導(dǎo)論[M]. 北京：科學(xué)出版社，2010.

[33] 白 燕，李 蕊，程 濤，等. 正交設(shè)計(jì)和均勻設(shè)計(jì)用于硒-金膜修飾電極制備條件的選擇[J]. 分析試驗(yàn)室，2003，22（6）：9-12.

[34] 楊培慧，周志軍，馮德雄，等. 硒代蛋氨酸的電化學(xué)行為及其定量分析[J]. 分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2004，20（1）：19-22.

[35] 程建中，楊 萍，桂仁意，等. 植物硒形態(tài)分析的研究綜述[J]. 浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，29（2）：288-395.

（責(zé)任編輯：夏亞男）