表面等離子體諧振（SPR）技術(shù)在水稻堊白基因Chalk5 檢測(cè)中的應(yīng)用

摘 要：以堊白度低的明恢63與堊白度高的9311的基因組DNA為材料設(shè)計(jì)探針，構(gòu)建基于表面等離子體諧振（Surface Plasmon Resonance， SPR）技術(shù)的水稻堊白基因檢測(cè)方法，并用16個(gè)已知堊白度的水稻品種檢驗(yàn)該方法的可靠性。結(jié)果表明：通過生物素修飾后單聯(lián)DNA片段探針與羧基傳感芯片上鏈霉親和素（SA）的結(jié)合構(gòu)建基因芯片，再以100 μL 0.16 μmol/L的PCR產(chǎn)物與探針進(jìn)行分子雜交，可獲得較好的SPR信號(hào)；以該方法獲得的SPR信號(hào)差值的絕對(duì)值與水稻堊白成正相關(guān)關(guān)系，可定性判斷水稻品種堊白度的高低；同時(shí)，SPR檢測(cè)方法無需標(biāo)記，分析過程完全自動(dòng)化，可實(shí)現(xiàn)水稻堊白基因的快速檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：表面等離子體諧振（SPR）技術(shù)；水稻；堊白；Chalk5；基因芯片

中圖分類號(hào)：Q812 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-060X（2018）08-0001-04

Application of Surface Plasmon Resonance （SPR） Technique in Detection of Rice Chalk5 Gene

HUANG Wei-heng1， 2，WANG Xue-feng2， 3，XIN Ye-yun1， 2

（1. Hunan University ， Changsha 410012， PRC； 2. Hunan Hybrid Rice Research Center， Changsha 410125， PRC；

3. Hunan Agricultural University， Changsha 410128， PRC）

Abstract： Using genomic DNA of Minghui 63 with low chalkiness and 9311 with high chalkiness as probes， a method based on Surface Plasmon Resonance （SPR） was developed to detect Chalkiness in rice， and its reliability was tested by 16 rice varieties with known chalkiness. The results showed that single DNA fragment probes modified by biotin combining with streptavidin （SA） on carboxyl sensing chip to construct gene chip， PCR products of rice （100 μL 0.16 μmol/L） were subjected to molecular hybridization and get a more better SPR signal value； The difference of SPR signal obtained by this method is positively correlated with rice chalkiness， and the chalkiness of rice varieties can be qualitatively judged； at the same time， the SPR method did not need markers， and the analysis process was completely automated， which can realize the rapid detection of rice chalkiness gene.

Key words： surface plasmon resonance； rice； grain chalkiness； Chalk5； gene chip

水稻是全世界重要的糧食作物之一。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展以及人們生活水平的不斷提高，人們對(duì)水稻品質(zhì)的要求也不斷提升。因此，選育品質(zhì)優(yōu)良的水稻新品種成為水稻育種重要目標(biāo)之一。20世紀(jì)70年代開始我國(guó)大面積推廣雜交水稻，并開展了一系列稻米品質(zhì)改良的研究，經(jīng)過多年努力，我國(guó)在提高雜交水稻品質(zhì)方面取得了較好的成果[1-2]。但某些米質(zhì)性質(zhì)如堊白度、堊白粒率等達(dá)標(biāo)率仍不高[3-4]。

堊白是指稻米胚乳中組織疏松而形成的白色不透明部分，它極大地影響了稻米可食用性，是衡量水稻外觀品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)。堊白基因控制座位比較復(fù)雜，其中Chalk5是一個(gè)能顯著降低稻米堊白的主效基因[5]，Chalk5基因mRNA含量的不同，導(dǎo)致水稻堊白的含量差異；在一些品種中，堊白受Chalk8-1、Chalk8-2、Chalk8-3和Chalk10 等基因的控制；另外，還有影響堊白的一些微效基因起作用[5-8]。因此，建立快速、準(zhǔn)確檢測(cè)堊白相關(guān)基因的方法是選育低堊白水稻品種的基礎(chǔ)。

表面等離子體諧振（SPR）技術(shù)是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的一種新技術(shù)。該技術(shù)應(yīng)用SPR光學(xué)原理檢測(cè)生物傳感芯片（biosensor chip）上配位體與分析物之間的相互作用情況，廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。SPR的基本原理為在玻璃棱鏡表面鍍了一層50 nm左右的金屬納米膜，光以不同的入射角射入納米膜層發(fā)生全反射并產(chǎn)生表面諧振現(xiàn)象。發(fā)生諧振時(shí)入射角是由金屬界面的折射率決定的，而金屬界面上生物分子的結(jié)合會(huì)改變此處的折射率，從而引起諧振角的改變，通過監(jiān)測(cè)諧振角的變化，可以實(shí)時(shí)檢測(cè)芯片表面生物分子的結(jié)合與分離的狀態(tài)[9-11]。該技術(shù)無需標(biāo)記、無需分離純化，可用于實(shí)時(shí)定量檢測(cè)固定在傳感芯片上組分[9]?；赟PR傳感器工作原理，通過生物薄膜技術(shù)、分子雜交技術(shù)等在生物表面基質(zhì)層上包裹SA蛋白，就可對(duì)溶液中特定的生物分子進(jìn)行檢測(cè)。

研究以米質(zhì)好堊白度低的明恢63與米質(zhì)差堊白度高的9311的基因組DNA為材料設(shè)計(jì)探針，構(gòu)建基于SPR技術(shù)的水稻堊白基因檢測(cè)方法，并用16個(gè)已知堊白度的水稻品種檢測(cè)SPR方法的可靠性，以期建立一種高靈敏度、高準(zhǔn)確性、快速檢測(cè)水稻堊白的方法，為提高水稻育種效率提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

研究所用的16個(gè)水稻品種（表1）均由湖南雜交水稻研究中心提供?；A(chǔ)的SPR芯片、用于SA固定的溶液都是由北京華安麥科生物技術(shù)有限公司提供。SPR儀器為項(xiàng)目組共同研發(fā)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 水稻基因組DNA的提取及處理 采用常規(guī)的CTAB法[12]提取水稻基因組DNA，將提取的DNA溶解于50 μL ddH2O中，置于Nanodrop 2 000分光光度計(jì)檢測(cè)，取OD260/280值在1.7～2.0之間的DNA樣品作為PCR的模板，保存于-20℃冰箱中備用。

1.2.2 PCR擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè) PCR反應(yīng)體系（60 μL）：

2×Eco Taq PCR Super mix 30 μL，SSR引物（Chalk-F：

3'-CATCCAAATAGAGGAGCCAC-5'；Chalk-R：3'-TGAA

AAAGCCATAAAAAAGC-5'）3 μL，DNA模板為6 μL，dd

H2O 21 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min，98℃變性10 s，58℃退火30 s，72℃延伸50 s，34個(gè)循環(huán)；72℃ 4 min，16℃保溫1 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，保留擴(kuò)增出條帶的PCR產(chǎn)物。

1.2.3 芯片探針的設(shè)計(jì) 參照陳忠等[13]的方法設(shè)計(jì)探針，采用單鏈DNA探針，長(zhǎng)度為20～60 bp，5′端連接polyA，3′端進(jìn)行生物素修飾（擎科生物公司合成）。水稻堊白基因Chalk5有多個(gè)基因位點(diǎn)跟水稻堊白相關(guān)聯(lián)，根據(jù)參考文獻(xiàn)[8]中9311和明恢63基因序列在啟動(dòng)子979～991區(qū)間的缺失差異，設(shè)計(jì)單鏈DNA探針如表2所示。

1.2.4 鏈霉親和素（SA）的固定 將羧基修飾的SPR芯片IB-CM（華安麥科生物公司）安裝到SPR儀器上，取200 μL EDC（N-羥基琥珀酰亞胺）和NHS[1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽]的混合溶液（0.010 g NHS和0.050 g EDC共同溶于4 mL ddH2O）流經(jīng)過芯片表面，反應(yīng)20 min，活化羧基。然后，取200 μL 50 μg/mL的鏈霉親和素（SA）溶液（溶劑為0.01 mol/L以HCl調(diào)pH值為4.5的醋酸緩沖液溶）流經(jīng)過芯片表面，反應(yīng)20 min，將200 μL BSA溶液（1.0 mol以HCl調(diào)pH值為8.4的乙醇胺溶液）流經(jīng)過芯片表面以封閉殘存的活性位點(diǎn)。

1.2.5 探針與芯片的連接 將修飾過的SPR芯片安裝到SPR儀器上，取100 μL 1.0 mol/L探針溶液以10 μL/min流速流過芯片表面，使探針連接到芯片表面。

1.2.6 PCR產(chǎn)物檢測(cè)濃度的選擇 將15×SSPE緩沖溶液、ddH2O、PCR待測(cè)產(chǎn)物（來自9311與空育131這2個(gè)品種）混合，配制100 μL濃度分別為0.25、0.16 μmol/L的溶液流經(jīng)過芯片，反應(yīng)10 min，以確定最適的PCR產(chǎn)物濃度。

1.2.7 基于SPR技術(shù)的水稻基因檢測(cè)及分析 根據(jù)上述確定的最適PCR產(chǎn)物濃度，取16 μL PCR產(chǎn)物、34 μL 15×SSPE緩沖溶液、50 μL ddH2O混勻，95℃加熱變性3 min，100 μL樣品上樣，在SPR儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)倉(cāng)溫度40℃，反應(yīng)10 min，記錄SPR信號(hào)。根據(jù)SPR信號(hào)值結(jié)果，對(duì)水稻的米質(zhì)堊白度進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR產(chǎn)物檢測(cè)濃度的選擇

由圖1可知，當(dāng)9311與空育131的PCR產(chǎn)物濃度為0.25、0.16 μmol/L時(shí)都有結(jié)合信號(hào)，9311材料中，0.16 μmol/L濃度SPR信號(hào)比0.25 μmol/L濃度信號(hào)明顯增強(qiáng)；空育131材料中，0.25 μmol/L濃度SPR信號(hào)比0.16 μmol/L濃度信號(hào)微弱增強(qiáng)。相比較下9311材料在0.16 μmol/L濃度SPR信號(hào)更加強(qiáng)，故選擇PCR產(chǎn)物在0.16 μmol/L濃度時(shí)進(jìn)行分子雜交。

2.2 分子雜交檢測(cè)結(jié)果與真實(shí)值的對(duì)比分析

試驗(yàn)采用米質(zhì)好堊白度低的明恢63與米質(zhì)差堊白度高的9311的基因組DNA作為探針設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)，故以9311與明恢63的SPR信號(hào)值為基準(zhǔn)值，SPR儀器檢測(cè)信號(hào)值波動(dòng)范圍為±20。根據(jù)表3中SPR信

3 結(jié)論與討論

研究中，采用羧基修飾的SPR芯片，選擇分子雜交濃度。由SPR信號(hào)值可知，在0.16 μmol/L濃度下，分子雜交信號(hào)值最大。這可能與探針的結(jié)合率有關(guān)系，加入100 μL 0.16 μmol/L的PCR產(chǎn)物足以達(dá)到探針的飽和度，提高探針與待測(cè)物的接觸率，增加兩者結(jié)合的概率，進(jìn)而提高檢測(cè)的分辨率。

利用新建立的SPR法檢測(cè)16種水稻品系樣本，并且與已經(jīng)公布的堊白度值進(jìn)行比較。發(fā)現(xiàn)各品種與對(duì)照的SPR信號(hào)差值的絕對(duì)值與公布的堊白度值基本成正相關(guān)關(guān)系。

常規(guī)SPR檢測(cè)方法為直接SPR信號(hào)檢測(cè)法，即將一個(gè)分子固定在芯片上，當(dāng)樣本流過芯片時(shí)，與芯片上的分子進(jìn)行連接，再用清水洗掉沒有連接上的樣本，直接檢測(cè)所產(chǎn)生的信號(hào)值。直接檢測(cè)法可能會(huì)因背景不同等原因造成信號(hào)值不準(zhǔn)確。研究中采用的是間接SPR檢測(cè)法，通過差值的絕對(duì)值，消除了背景的影響，使SPR信號(hào)表達(dá)更加準(zhǔn)確。

與常規(guī)SPR檢測(cè)方法相比，該研究創(chuàng)新的SPR方法無需標(biāo)記，直接通過分子結(jié)合就能夠產(chǎn)生足夠的SPR信號(hào)完成檢測(cè)，可實(shí)現(xiàn)水稻堊白的快速檢測(cè)，使分析更加簡(jiǎn)便快捷。常規(guī)方法檢測(cè)一個(gè)品質(zhì)大約需要一周的時(shí)間，而SPR方法完成一次檢測(cè)只需20 min左右，且樣品處理后，分析過程完全自動(dòng)化，能避免或減少個(gè)體操作誤差。

但這種方法只能定性預(yù)測(cè)水稻堊白的高與低，不能精確的計(jì)算出堊白度，因此該方法還需進(jìn)一步改進(jìn)。同時(shí)，SPR檢測(cè)方法的探針只能根據(jù)已有的基因及序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，因而只能檢測(cè)一些已經(jīng)克隆的基因，而不能檢測(cè)未知基因，加上探針修飾采用的是化學(xué)方法，這些都加大了探針設(shè)計(jì)的難度，今后在這一方面也有待進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯：成 平）