復(fù)合酶法輔助提取柚子皮多糖的工藝優(yōu)化

摘 要：為了優(yōu)化復(fù)合酶輔助提取柚子皮多糖的工藝，以柚皮為原料，利用纖維素酶與果膠酶輔助提取，以多糖得率為指標(biāo)，對(duì)提取過程中纖維素酶與果膠酶的用量、提取時(shí)間、提取溫度和pH值等工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：優(yōu)化后工藝條件為酶用量2.0%、提取溫度60℃、pH值為4.0、提取時(shí)間80 min，柚子皮中多糖的平均得率為8.26%。這說明利用纖維素酶與果膠酶輔助提取柚子皮多糖的提取率較高，方法穩(wěn)定可行。

關(guān)鍵詞：柚子皮；多糖；纖維素酶；果膠酶；復(fù)合酶

中圖分類號(hào)：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-060X（2018）05-0086-03

Optimization of Polysaccharides Extraction from Pomelo Peel by Compound Enzymes Method

WANG Ying1，CHEN Yuan2，NIE Qian-qian1，LI Ling1，ZHANG Yu1

（Department of Pharmacy， Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College， Taizhou 225300， PRC）

Abstract： In order to optimize the compound enzymes assisted extraction process of polysaccharides from pomelo peel，the pomelo peel were used as raw material to extract polysaccharides by compound enzymes method. The optimum extraction conditions were established by single-factor experiment and orthogonal analysis with polysaccharides yield as an index. The results showed that the optimum extraction conditions were as follows， compound enzymes addition was 2.0%， and pH 4.0 for 80min extraction at 60℃， the average yield of polysaccharides was 8.26%.In Conclusion， the extraction technology is stable and practical with high extraction rate.

Key words：pomelo peel； polysaccharide； cellulose； pectinase； compound enzymes

柚子味道酸甜，氣味芳香，富含多種營(yíng)養(yǎng)成分，是一種廣受歡迎的水果。柚子皮占柚子質(zhì)量的40%以上，除含有水、維生素和礦物質(zhì)等成分外[1]，還含有許多不同種類的生理活性成分，如黃酮[2]、果膠[3]、精油、天然色素和膳食纖維[4]等，具有很高的藥用價(jià)值。柚子皮多糖是柚子皮中的主要活性成分之一[5]，具有降血脂、降膽固醇等作用[6]。

柚子皮中含有豐富的纖維素和果膠，試驗(yàn)在傳統(tǒng)的水提醇沉法提取柚子皮多糖的基礎(chǔ)上[7]，引入纖維素酶和果膠酶，利用纖維素酶和果膠酶的破壁能力[8]，以期提高可溶性柚皮多糖的提取得率。通過對(duì)提取溫度、時(shí)間、酶用量、pH值等因素的考察，以正交試驗(yàn)優(yōu)化最佳工藝條件，確定復(fù)合酶法輔助提取柚子皮多糖的最佳工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

將購(gòu)自廣東梅州的柚子內(nèi)皮進(jìn)行粉碎，過20目篩，置于烘箱中干燥，然后密封貯藏，備用。

試驗(yàn)試劑：無水葡萄糖對(duì)照品（HPLC≥98%，上海金穗生物有限公司），纖維素酶、果膠酶（BR級(jí)，滬試），其余試劑為市售分析純。

試驗(yàn)儀器：HK-02A多功能粉碎機(jī)（上海燁昌食品機(jī)械有限公司）、AL104電子天平（梅特勒-托利多）、SHA-B雙功能水浴恒溫振蕩器（金壇市杰瑞爾電器有限公司）、UV754N紫外-可見分光光度計(jì)（上海精科儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 柚子皮多糖的提取流程 稱量干燥的柚子皮粗粉5 g，放入250 mL錐形瓶，加入適量的纖維素酶與果膠酶，并加入磷酸氫二鈉檸檬酸緩沖液。將錐形瓶置于水浴恒溫振蕩器中，經(jīng)酶處理一段時(shí)間后，抽濾，收集濾液，蒸發(fā)濃縮，冷卻。將無水乙醇慢慢加入到濃縮液中并不斷攪拌，添加量為濃縮液的1.5倍，靜置40 min，抽濾，所得濾餅即為柚子皮粗多糖。將柚子皮粗多糖用蒸餾水溶解并定容至250 mL，得柚子皮粗多糖溶液。

1.2.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) （1）酶的用量：稱取5份柚子皮粗粉，每份5 g，分別加入柚子皮粉質(zhì)量0.5%、1%、1.5%、2%和2.5%的復(fù)合酶（m纖維素酶∶m果膠酶=1∶1）及pH值為5.0的緩沖液150 mL，料液比為1∶30[13]，50℃，酶處理60 min，隨后按1.2.1的流程提取柚子皮多糖。（2）提取pH值：稱取5份柚子皮粗粉，每份5 g，依次加入pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的緩沖液150 mL，并加入柚子皮粉質(zhì)量1.5%的復(fù)合酶，50℃，酶處理60 min，隨后按1.2.1的流程提取柚子皮多糖。（3）提取溫度：稱取5份柚子皮粗粉，每份5 g，每份中加入pH值 5.0緩沖液150 mL及柚子皮粉質(zhì)量1.5%的復(fù)合酶，分別在30、40、50、60、70℃下酶處理60 min，隨后按1.2.1的流程提取柚子皮多糖。（4）提取時(shí)間：稱取5份柚子皮粗粉，每份5 g，每份中加入pH 值5.0緩沖液的150 mL及柚子皮粉質(zhì)量1.5%的復(fù)合酶，50℃下，分別處理20、40、60、80、100 min，隨后按1.2.1的流程提取柚子皮多糖。

1.2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 為了優(yōu)化復(fù)合酶法提取工藝條件，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定正交試驗(yàn)的因素與水平，如表1所示。

1.2.4 柚子皮多糖的測(cè)定 采用苯酚硫酸法測(cè)定多糖的含量。根據(jù)池源等[9]報(bào)道的方法，以吸光度（A486）為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度（C）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A486=1.504 6C-0.019 3，R2=0.992 4。這表明，苯酚硫酸法測(cè)定葡萄糖的濃度，在20～100 μg/mL的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。取樣品溶液1 mL于10 mL具塞比色管中，加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，加入硫酸5 mL，加蒸餾水至10 mL，搖勻，放置10 min；置40℃水浴鍋中保溫18 min，取出后冷卻至室溫；以相應(yīng)的試劑為空白，在486 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。

柚子皮多糖的得率（%）=

式中，C為多糖濃度（μg/mL），V為多糖提取液的總體積（mL），k為提取液稀釋倍數(shù)，m為柚子皮粉的質(zhì)量（g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

柚皮干樣中果膠與纖維素等膳食纖維的質(zhì)量比約29∶23[10]，參考屈小玄等[11-12]的研究，在試驗(yàn)過程中使用等質(zhì)量的纖維素酶和果膠酶輔助提取柚子皮中水溶性多糖。

2.1.1 酶用量對(duì)多糖得率的影響 由圖1可知，在復(fù)合酶用量低于1.5%時(shí)，柚子皮多糖的得率逐漸增高且提升速度很快，復(fù)合酶用量超過1.5%后，柚子皮多糖得率上升趨于平緩。由于柚子皮中富含纖維素和果膠，加入纖維素酶和果膠酶能加快分解纖維素和果膠，破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)[13]，從而讓胞內(nèi)的可溶性多糖快速溶出，進(jìn)而提高多糖的得率。

2.1.2 提取pH值對(duì)多糖得率的影響 如圖2所示，提取體系pH值在4.0～6.0范圍內(nèi)，柚子皮多糖的得率較高。這是因?yàn)樵囼?yàn)所用的纖維素酶酶的最適pH值為4.2～5.2，果膠酶在pH值 3.0～7.0的范圍內(nèi)，適合產(chǎn)物生成[14]。pH值過高或過低，均會(huì)降低酶的活性，細(xì)胞破壁程度降低，影響胞內(nèi)多糖的滲出。此外，過低的pH值會(huì)破壞多糖分子中的苷鍵[15]，將多糖分子裂解為小分子寡糖甚至單糖，進(jìn)一步降低多糖的得率。

2.1.3 提取溫度對(duì)多糖得率的影響 從圖3可以看出，隨著水浴溫度的升高，柚子皮多糖的得率逐漸增大，當(dāng)溫度達(dá)到50℃時(shí)，柚子皮多糖的得率達(dá)到最大值，50℃之后，柚子皮多糖的得率明顯降低。溫度升高，有助于酶解效率的提高和柚子皮多糖分子的擴(kuò)散；但是當(dāng)提取溫度超過50℃時(shí)，長(zhǎng)時(shí)間加熱，大部分纖維素酶和果膠酶被破壞[16]，發(fā)生不可逆變性，影響細(xì)胞破壁；另外，較高的溫度亦會(huì)加快多糖糖苷鍵的裂解，從而降低柚子皮多糖的得率。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響 由圖4可知，隨著水浴加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，柚子皮多糖的得率雖然不斷增加，但是當(dāng)時(shí)間增加至60 min后，柚子皮多糖的得率趨于平穩(wěn)。這是因?yàn)殡S著酶處理時(shí)間的延長(zhǎng)，越來越多的多糖釋放到提取液中，細(xì)胞內(nèi)與提取液中多糖的濃度梯度逐漸減小，當(dāng)擴(kuò)散達(dá)到平衡，繼續(xù)增加時(shí)間，多糖得率增長(zhǎng)甚微[17]。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

從表2可以看出，4個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響強(qiáng)弱依次為提取時(shí)間>pH值>酶用量>提取溫度；而最佳條件為酶用量2.0%、提取溫度60℃、pH值為4.0、提取時(shí)間80 min。

2.3 最佳條件驗(yàn)證

根據(jù)單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化后的柚子皮多糖提取最佳工藝條件，平行進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，多糖得率分別為8.19%、8.31%、8.28%，平均得率為8.26%，RSD為0.76%。這表明試驗(yàn)結(jié)果基本穩(wěn)定，重復(fù)性較好。

3 結(jié) 論

柚子皮多糖有重要的藥用價(jià)值，同時(shí)具有多種生理活性作用，醫(yī)藥開發(fā)前景廣闊。試驗(yàn)以柚子皮粗粉為原料，采取復(fù)合酶法對(duì)柚子皮中多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，通過苯酚-硫酸法測(cè)定柚子皮多糖的得率?？疾炝嗣赣昧?、pH值、提取時(shí)間及提取溫度等因素的影響。結(jié)果表明，柚子皮多糖的最佳提取工藝條件為酶用量2.0%、提取溫度60℃、pH值為4.0、提取時(shí)間80 min，柚子皮中多糖的平均得率為8.26%。與水提醇沉法及纖維素酶輔助提取法相比，采用復(fù)合酶法輔助提取柚皮多糖，提取時(shí)間大幅縮短，柚皮多糖得率亦有明顯提升[18]。

采用復(fù)合酶法輔助提取柚皮多糖，提取溫度相對(duì)較低，對(duì)多糖分子的結(jié)構(gòu)影響較小，并能有效降低能耗，

故此法可為柚皮的綜合利用及多糖的提取提供借鑒。

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（責(zé)任編輯：成 平）