釀酒酵母JM14對養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽去除效果研究

摘 要：為了降低養(yǎng)殖水體中的硝態(tài)氮，以1株具有氨氮去除能力的釀酒酵母JM14菌株為材料，通過單因素試驗，分別研究了初始亞硝酸鹽濃度、pH值、培養(yǎng)溫度和接種量對其亞硝酸鹽去除能力的影響。結(jié)果表明：該菌株對亞硝酸鹽的去除率在培養(yǎng)96 h時達到最高值，為68.3%；當初始亞硝酸鹽濃度為1～10 mg/L時，菌株對亞硝酸鹽去除率均保持在59%以上；當亞硝酸鹽濃度達到20和30 mg/L時，亞硝酸鹽去除率顯著降低；菌株去除亞硝酸鹽的最適初始pH值范圍為6～10，最適培養(yǎng)溫度為25～30℃，最佳接種量為≥2%。綜合來看，釀酒酵母JM14具有去除水體中氨氮和亞硝酸鹽的能力，對環(huán)境安全，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有較廣闊的應用前景。

關鍵詞：釀酒酵母JM14；亞硝酸鹽去除；養(yǎng)殖水體

中圖分類號：S949 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2018）05-0001-04

Efficiency of Nitrite Removed from Aquaculture Water by Saccharomyces cerevisiae JM14

CHEN Hai-yan，WANG Bin，CHEN Wei，LIU Biao

（Hunan Microbiology Institute， Changsha 410009， PRC）

Abstract： In order to remove the nitrite in aquaculture water， Saccharomyces cerevisiae JM14， an effective ammonia removal strain， was used to study its nitrite removal efficiency with different initial nitrite concentrations， pH， temperature and inoculums amount （V/V）. The results showed that the highest degradation rate of JM14 on the nitrite achieved at 68.3% for 96 h. Its removal rate to 1-10 mg/L nitrite was up to 59%， while it was greatly decreased when the nitrite concentration was 20 mg/L or 30 mg/L. The optimum initial pH for the nitrite removal efficiency of strain JM14 was from 6 to 10， and the optimum temperature was 25-30℃. The optimum inoculums amount was greater than 2%. Saccharomyces cerevisiae JM14 exhibited good potential for future applications in aquaculture for its ammonium， nitrite removal efficiency and environmental safety.

Key words：Saccharomyces cerevisiae JM14； nitrite removal； aquaculture water

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖集約化的發(fā)展，養(yǎng)殖密度和規(guī)模不斷加大，導致水體中普遍存在亞硝酸鹽超標的情況[1]。亞硝酸鹽是養(yǎng)殖水體中主要污染物之一，當水中亞硝酸鹽濃度積累到一定量后，該鹽便會通過鰓和體表進入魚蝦等水生動物的血液，進而與血液中運輸氧氣的蛋白質(zhì)結(jié)合，使之失去攜氧能力而導致動物暴發(fā)疾病，甚至出現(xiàn)大批死亡現(xiàn)象，最終造成重大的經(jīng)濟損失[2-4]。養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽超標的問題，在一定程度上影響了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，因而需要采取有效措施對水體中的亞硝酸鹽進行控制。目前，去除養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽的主要方法有物理法、化學法和生物法，其中生物法以其效率高、成本低、易操作等優(yōu)點成為廣大研究者關注的熱點。據(jù)文獻報道，芽孢桿菌、乳酸菌、假單胞菌、不動桿菌（Acinetobacte）、片球菌、腸膜明串珠菌[4-11]等菌株都對水體中亞硝酸鹽有良好的去除效果。

湖南省微生物研究院實驗室在前期研究中，分離篩選出一株對養(yǎng)殖水體中的氨氮具有較強去除能力的釀酒酵母JM14。當水體中初始氨氮濃度為212 mg/L時，該菌株對氨氮的降解率可達91.4%，具有廣闊的應用前景[12]。一般情況下，養(yǎng)殖水體中氨氮和亞硝酸鹽超標的現(xiàn)象是同時存在的，因此筆者擬探討菌株JM14對水體中亞硝酸鹽的去除效果，并利用單因子法研究了不同因素對其亞硝酸鹽去除效率的影響，旨在為該菌在養(yǎng)殖水體中的實際應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種來源 釀酒酵母菌株JM14由實驗室從長沙市某克氏原螯蝦養(yǎng)殖基地的養(yǎng)殖水體中分離獲得，并保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 酵母菌發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖 20.0 g/L，（NH4）2SO4 10.0 g/L，氯化鈣6.0 g/L，生物素0.1 g/L，NaCl 0.1 g/L，MgSO4 0.5 g/L，pH值7.0。亞硝酸鹽降解測定培養(yǎng)基：丁二酸鈉 4.72 g/L，亞硝酸鈉 0.05 g/L，KH2PO41.5 g/L，Na2HPO4 0.42 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L，pH值7.0。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株JM14菌液的制備 接種菌株JM14種子液到酵母菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)3 d，菌液離心，棄上清，用蒸餾水反復洗滌菌體3次，最后加入適量的蒸餾水配制成菌懸液（活菌數(shù)約為4.0×108 CFU/mL），備用。

1.2.2 菌株對亞硝酸鹽降解能力的測定 以2%接種量（V/V）接種JM14菌懸液到亞硝酸鹽降解測定培養(yǎng)基中，以接種空白培養(yǎng)基作為對照，于28℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)，分別于24、48、72、96、120 h測定樣品中的亞硝酸鹽含量，并計算各個時間點菌株對亞硝酸鹽的去除率。亞硝酸鹽的含量采用 N-（1-萘基）–乙二胺分光光度法測定[13]。根據(jù)以下公式計算各個處理的亞硝酸鹽去除率（R）：R=（空白對照組亞硝酸鹽含量-處理組亞硝酸鹽含量）/空白對照組亞硝酸鹽含量×100%

1.2.3 不同因素對亞硝酸鹽去除效果的影響 （1）初始亞硝酸鹽濃度。將JM14菌懸液以2%接種量（V/V）接種于初始亞硝酸鹽濃度分別為1、2、5、10、20、30 mg/L的降解測定培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)96 h，測定菌株JM14對亞硝酸鹽的去除率。（2） pH 值。分別調(diào)節(jié)亞硝酸鹽降解測定培養(yǎng)基的初始pH值為4、5、6、7、8、9、10和11，然后以2 %接種量（V/V）接種JM14菌懸液，28℃、180 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)96 h后測定菌株JM14對亞硝酸鹽的去除率。（3）溫度。以2%接種量（V/V）接種JM14菌懸液于亞硝酸鹽降解測定培養(yǎng)基中，分別于15、20、25、30、35、40℃條件下，180 r/min振蕩培養(yǎng)96 h 后測定菌株JM14對亞硝酸鹽的去除率。（4）接種量。按照1%、2%、3%、4%、5%、6%的接種量（V/V），將JM14菌懸液接種于亞硝酸鹽降解測定培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)96 h，測定各添加量對菌株JM14亞硝酸鹽的去除率的影響。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用Excel 2003和SPSS 18.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行作圖與生物統(tǒng)計分析，不同處理間的差異顯著性比較采用One-way ANOVA方法進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株JM14不同時間點對亞硝酸鹽的去除能力

如圖1所示，菌株JM14對亞硝酸鹽的去除率隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸增大，培養(yǎng)96 h時，去除率達到最高值，為68.3%；此后，隨著培養(yǎng)時間的延長，去除率沒有顯著變化。菌株JM14在適宜的條件下，其

對水體中的氨氮降解率可達91.4%[12]，說明該菌株對水

體中氨氮的降解能力優(yōu)于其對亞硝酸鹽的降解能力。

2.2 初始亞硝酸鹽濃度對菌株JM14亞硝酸鹽去除能力的影響

如圖2所示，亞硝酸鹽底物濃度為1～10 mg/L時，菌株JM14對亞硝酸鹽的去除率均達到59%以上，不同濃度間無顯著性差異；但當亞硝酸鹽濃度提高至20 mg/L時，菌株JM14對亞硝酸鹽去除率降低至42.7%；當亞硝酸鹽濃度達到30 mg/L時，菌株JM14對亞硝酸鹽去除率進一步降至25.6%。

2.3 初始pH值對菌株去除亞硝酸鹽效果的影響

如圖3所示，當初始pH值范圍為4～6時，隨著pH值的升高，菌株JM14對亞硝酸鹽的去除率逐漸增大；當培養(yǎng)基初始pH值為6～10時，菌株JM14對亞硝酸鹽的去除率均大于62%，區(qū)間內(nèi)各處理的去除率沒有顯著性差異；當初始pH值為10～11時，菌株JM14對亞硝酸鹽的去除率隨著pH值的升高而顯著降低。試驗結(jié)果表明，菌株JM14去除亞硝酸鹽的最適初始pH值范圍為6～10。

2.4 培養(yǎng)溫度對菌株JM14亞硝酸鹽去除能力的影響

溫度是影響微生物生長代謝的重要因素之一，也是影響生物除氮效果的關鍵因素。如圖4所示，菌株JM14在15～40℃條件下均能去除水體中的亞硝酸鹽；在25～30℃范圍內(nèi)，菌株JM14對亞硝酸鹽的去除率最高，達到64%以上；高于或低于此溫度范圍，菌株對亞硝酸鹽的去除效果均顯著降低（P<0.05）。

2.5 接種量菌株JM14亞硝酸鹽去除能力的影響

如圖5所示，當接種量從1%增加至2%時，菌株JM14對亞硝酸鹽的去除率從51.2%增大至63.7%。當接種量在2%～6%范圍時，菌株JM14對亞硝酸鹽的去除率無顯著變化，均表現(xiàn)出良好的去除亞硝酸鹽效果，結(jié)合成本考慮，在實際應用時，以2%的接種量為最宜。

3 結(jié)論與討論

實驗室在前期研究中，從養(yǎng)殖水體中分離篩選獲得一株有較強氨氮降解能力的菌株JM14，經(jīng)鑒定為釀酒酵母。該菌株對亞硝酸鹽的去除率在培養(yǎng)96 h時達到最高值，為68.3%。單因素試驗結(jié)果顯示，在亞硝酸鹽底物濃度為1～10 mg/L時，菌株對亞硝酸鹽去除率均保持在59%以上；當亞硝酸鹽濃度達到20和30 mg/L時，去除率顯著降低。菌株JM14去除亞硝酸鹽的最適初始pH范圍為6～10，去除率保持在62%以上；菌株去除亞硝酸鹽的最適溫度25～30 ℃，最佳接種量為≥2%。

在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，水體的理化條件處于不斷變化的狀態(tài)，水體中微生物對亞硝酸鹽的去除效果也會隨著環(huán)境條件的變化而有所不同。每種微生物都有其生長最適pH值范圍，在最適范圍內(nèi)酶活性也最高。菌株JM14在pH值范圍為6～10時都能較好地發(fā)揮去除亞硝酸鹽的作用，說明該菌株的pH值適應范圍廣，這一特性與蘇艷秋等[4]報道的菌株N-F-0117類似。菌株JM14去除亞硝酸鹽的最適溫度25～30℃，高于或低于此溫度，菌株的亞硝酸鹽去除能力均顯著降低。導致這種結(jié)果一方面可能是由于溫度會影響微生物的生長繁殖及代謝活動，另一方面是因為亞硝酸鹽的去除過程是一系列的酶促反應，其反應速率也受溫度影響[14]。

養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽濃度過高，不僅會對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物產(chǎn)生毒害作用，而且還會影響水體中有益微生物的活性。試驗結(jié)果表明，亞硝酸鹽濃度對菌株JM14亞硝酸鹽去除能力的影響與王會聰?shù)萚10]、于愛茸等[15]的研究結(jié)果相近，推測其原因可能是水體中的亞硝酸鹽對微生物去亞硝酸鹽相關酶的合成具有一定的影響。

菌株JM14對養(yǎng)殖水體中的亞硝酸鹽和氨氮均有一定的去除效果，且該菌株pH值適應范圍廣，對環(huán)境安全，適用于養(yǎng)殖廢水的處理與凈化，但是關于其在生產(chǎn)養(yǎng)殖過程中的實際水質(zhì)調(diào)控效果還需后續(xù)進一步研究。

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（責任編輯：成 平）