厚樸多酚的提取及體內(nèi)抗氧化研究

摘要：抗氧化活性是研究動(dòng)物抗衰老的重要方面。以厚樸樹皮為原料，比較超聲波法和浸提法提取厚樸多酚的含量差異，并研究了厚樸多酚對(duì)KM小鼠體內(nèi)抗氧化活性和有害性。結(jié)果表明：采用超聲波提取法提取得到的多酚純度為76.67%，高于浸提法（64.11%）；厚樸多酚進(jìn)行分組對(duì)比試驗(yàn)，灌胃飼養(yǎng)試驗(yàn)表明：KM小鼠血清中抑制羥自由基的能力和抗氧化成分（T-SOD、CAT、GSH-Px）的活性都得到提升，而有害的成分丙二醛MDA的含量有所降低。因此，厚樸多酚有抗氧化作用，有可能使動(dòng)物健康生活，從而達(dá)到抗衰老的效果。

關(guān)鍵詞：厚樸多酚；KM小鼠；灌胃；血清；活性

中圖分類號(hào)：R284 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-060X（2018）03-0029-04

厚樸（Magnolia officinalis）為我國(guó)著名的中藥，具有燥濕消痰、下氣除滿的功效，用于濕滯傷中、脘痞吐瀉、食積氣滯、腹脹便秘、痰飲喘咳。厚樸樹皮具有化濕導(dǎo)滯、下氣除滿、化食消痰、驅(qū)風(fēng)鎮(zhèn)痛等功效；種子有明日益氣之功效，芽可作婦科藥用，還可以加入癌癥藥物中。目前，藿香正氣丸、開郁順氣丸、香砂養(yǎng)胃丸、潤(rùn)通口服液等常用藥中均含有厚樸，其主要有效成分為厚樸酚與和厚樸酚。

厚樸樹皮中主要含有木脂素類化合物、揮發(fā)油、生物堿等成分。木脂素類化合物是厚樸中分離出的最主要化學(xué)成分，迄今為止，已分離出20多種，多數(shù)屬于新木脂素，主要有厚樸酚與和厚樸酚。厚樸中大約含有1%的揮發(fā)油，其中大部分都具有鎮(zhèn)靜作用，據(jù)研究，將提取的厚樸揮發(fā)油進(jìn)行GC-MS研究，分離出了48種成分，按葉油醇及其異構(gòu)體是主要成分，約占揮發(fā)油總量的40%～55%。揮發(fā)油普遍存在于樹皮、根皮、樹葉和花中，但是花與其他部位的揮發(fā)油的組分有較大的區(qū)別。厚樸樹皮中生物堿含量較高，王洪燕等對(duì)凹葉厚樸中生物堿的化學(xué)成分進(jìn)行研究，得到9個(gè)異喹啉生物堿。除此之外，有學(xué)者從厚樸樹皮材料中分離出了槲皮苷、蘆丁、花生酸、棕櫚酮、二十六烷醇、β-谷甾醇、胡蘿卜苷。

自由基是人體生命活動(dòng)中多種生化反應(yīng)產(chǎn)生的正常代謝產(chǎn)物。在正常情況下，人體內(nèi)的自由基是處于不斷產(chǎn)生與被清除的動(dòng)態(tài)平衡中，自由基是機(jī)體有效的防御系統(tǒng)，對(duì)維持機(jī)體正常代謝有一定促進(jìn)作用。但是自由基產(chǎn)生地過多或者清除地過慢，就會(huì)對(duì)人體細(xì)胞膜及大分子（如蛋白質(zhì)、DNA）產(chǎn)生一系列損害，加速機(jī)體的衰老過程并誘發(fā)各種疾病。因此，一些化學(xué)合成的抗氧化劑被廣泛用于食品和醫(yī)藥領(lǐng)域。但最近研究表明合成的氧化劑具有各種缺陷，例如BHT、BHA，由于它們會(huì)對(duì)人體器官造成傷害而遭到禁用。因此，尋找天然高效和低毒性抗氧化劑日益受到關(guān)注。而厚樸是我國(guó)傳統(tǒng)的中草藥，在全國(guó)制藥行業(yè)中利用厚樸配方的中成藥多達(dá)200余種。近年來，一些研究已發(fā)現(xiàn)厚樸酚可以保護(hù)小腸、腦和后肢的缺血和再灌注損傷。深入研究厚樸多酚的抗氧化作用，可以為進(jìn)一步研究和開發(fā)利用厚樸提供參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

KM小鼠，厚樸樹皮從湖南采購(gòu)。主要器材：CTXNW-10B超聲循環(huán)提取機(jī)（北京弘祥隆生物技術(shù)開發(fā)有限公司），功率200w；SHZ-3循環(huán)水多用真空泵；藥物粉碎機(jī)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。主要試劑：沒食子酸；DPPH；ABTS；所用的試劑盒均從南京建成生物工程研究所購(gòu)買，常用試劑均為AR級(jí)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1厚樸類化合物的提?。?）超聲波提取法。將烘干后的樹皮打碎成厚樸粉，過60目篩。參照李勝華對(duì)多穗柯總黃酮的提取工藝設(shè)計(jì)，稱取4 kg的厚樸粉加10倍量的80%乙醇浸泡24 h，超聲循環(huán)提取50 min，過濾得到粗多酚液，再減壓濃縮成漿狀，即可獲得粗提取液。（2）浸提法。該法由于工藝簡(jiǎn)便、成本低、純度高而被廣泛使用，但此法提取率低。稱取250 g厚樸粉，加10倍量的80%乙醇浸泡。每次攪拌相隔約為8 h，每天攪拌3次，浸泡3 d。過濾得到粗多酚液，再減壓濃縮成漿狀，即可獲得粗提取液。

1.2.2厚樸多酚類化合物的純化 D-101型大孔樹脂先進(jìn)行預(yù)處理，之后裝入層析柱，調(diào)節(jié)好流量1.0 mg/mL。將粗提取液倒入層析柱中，再依次用4L60%和30%的乙醇導(dǎo)入層析柱中進(jìn)行純化。將純化得到的溶液倒入瓷盤中，放入65%烘箱中烘干，再用研缽研碎，即可得到厚樸多酚粉。將粉末放入4℃冰箱中備用。

1.2.3厚樸多酚粉的多酚含量測(cè)定 精確稱取0.100 g沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)樣品。蒸餾水溶解并定容至1 000 mL。該標(biāo)準(zhǔn)液濃度為0.1 mg/mL。準(zhǔn)確量取上述標(biāo)準(zhǔn)液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL于50mL容量瓶中，各加30mL水，搖勻，再加2.5mLFC試劑，充分搖勻。1 min之后，加入碳酸鈉溶液（20%）7.5 mL，混勻定容。水浴75℃下反應(yīng)10min。于760nm波長(zhǎng)下比色，測(cè)定吸光度，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程（多酚含量以沒食子酸等價(jià)物表示）。

1.2.4厚樸多酚粉的多酚含量測(cè)定 準(zhǔn)確稱取50mg厚樸多酚粉末于50 mL容量瓶中，配成母液，采用梯度稀釋制得100倍稀釋液和200倍稀釋液，移取1mL稀釋液進(jìn)行測(cè)定。用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)得吸光值，將其代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程中，獲得樣品多酚濃度，再按公式（1）計(jì)算出多酚的含量。

多酚含量=（樣品濃度×樣品稀釋倍數(shù)）/取樣量×100% （1）

1.2.5厚樸多酚抗氧化活性試驗(yàn) （1）KM小鼠選擇。試驗(yàn)所用小鼠為體重在30±3g的KM小鼠50只，雌雄各25只，然后進(jìn)行隨機(jī)分組。分5組，每組5只雄、5只雌，雌雄分開，用苦味酸分別標(biāo)記左上肢，右上肢，左下肢，右下肢，背部。（2）灌胃試驗(yàn)。配制20mg/mL的厚樸多酚溶液，灌胃分高劑量組（400mg/kg）、中劑量組（200mg/kg）、低劑量組（100mg/kg）灌胃配制的厚樸多酚溶液，VC對(duì)照組用維生素C100 mg/kg劑量灌胃，空白對(duì)照組用水100mg/kg劑量灌胃。維生素每次灌胃前半小時(shí)配制。每?jī)商旆Q重1次。灌胃兩周，然后停止灌胃，休整1d之后取血處死。（3）取樣及處理。處死前提前先配制抗凝血?jiǎng)?，?shí)驗(yàn)用的抗凝血?jiǎng)┦菣幟仕徕c。試驗(yàn)過程：摘眼珠取血保存并標(biāo)記。小鼠取血滴加抗凝劑按7：1滴加，當(dāng)天離心分離血漿，離心用4000 r/min，離心時(shí)間6min，標(biāo)記好置于4℃冰箱臨時(shí)保存待用.

1.2.6指標(biāo)測(cè)定 用考馬斯亮蘭測(cè)定蛋白；硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA含量；黃嚓吟氧化酶法測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）的活性；DNTB直接比色法測(cè)定谷光甘膚過氧化物酶（GSH-px）的活性；可見光比色法測(cè)定過氧化氫酶（CAT）的活性。測(cè)定試驗(yàn)全部參照試劑盒的使用說明進(jìn)行。

1.2.7數(shù)據(jù)處理 通過SPSS19.0軟件系統(tǒng)計(jì)算均值、標(biāo)準(zhǔn)差，動(dòng)物試驗(yàn)部分的相應(yīng)數(shù)據(jù)用x±s表示，并用配對(duì)t檢驗(yàn)和兩樣本均數(shù)比較t檢驗(yàn)檢測(cè)其顯著性。

2結(jié)果與分析

2.1厚樸多酚粉的多酚含量測(cè)定

以沒食子酸溶液的濃度為橫坐標(biāo)，沒食子酸不同濃度的溶液所對(duì)應(yīng)的吸光值為縱坐標(biāo)繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），得到?jīng)]食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=89.179x-0.000 8，R²=0.9994，其中x：沒食子酸等價(jià)物質(zhì)量濃度（mg/mL）；y：溶液在510mm處吸光值。厚樸多酚粉的吸光值及多酚含量如表1所示。

由表1可知，兩種方法提取厚樸多酚得到的純化物的含量均較高，超聲波提取法（76.67%）明顯優(yōu)于浸提法（64.11%）。因此，試驗(yàn)選取用超聲波提取法得到的純化物作為體內(nèi)抗氧化的試驗(yàn)材料。

2.2血清中蛋白含量測(cè)定

由表2可知，不同灌胃組之間的蛋白含量均達(dá)到了85 g/L，各組間蛋白含量沒有顯著差異（P>0.05），說明厚樸多酚對(duì)于小鼠血漿中的蛋白含量沒有顯著影響。

2.3抑制羥自由基能力的測(cè)定

用生理鹽水將血清（漿）按1：1、1：4、1：9、1：19、1：49、1：99等稀釋成一系列不同濃度的血漿，分別取不同濃度的血漿0.2 mL按血清的測(cè)定操作表進(jìn)行檢測(cè)。

根據(jù)表3的試驗(yàn)結(jié)果，并結(jié)合試劑盒要求抑制率在45%～55%效果最為理想，此次的試驗(yàn)稀釋20倍時(shí)的抑制率在47.14%，符合要求，因此羥自由基測(cè)定試驗(yàn)采用20倍稀釋液進(jìn)行。經(jīng)過預(yù)試驗(yàn)，確定好了血漿樣品稀釋倍數(shù)，經(jīng)稀釋后，采用上述相同方法進(jìn)行試驗(yàn)，羥自由基測(cè)定的結(jié)果見表4。

由表4可知，灌胃不同劑量厚樸多酚呈現(xiàn)的抑制羥自由基的能力差異顯著（P<0.05），同時(shí)從抑制率可以看出高劑量組（55.83%）>中劑量組（46.78%）>低劑量組（45.59%）>空白對(duì)照組（45.20%），說明厚樸多酚對(duì)小鼠的藥理作用中，厚樸多酚的量與血漿中抑制羥自由基的能力成正相關(guān)。對(duì)比VC對(duì)照組可以看出，厚樸多酚對(duì)小鼠的有同樣的藥理作用，提高血漿中抑制羥自由基的活力；但低劑量組與VC組的對(duì)比表明，相同劑量的厚樸多酚的作用不如VC。試驗(yàn)結(jié)果表明，厚樸多酚類化合物增強(qiáng)了小鼠血清中抑制羥自由基的能力。這一結(jié)果與之前的許多研究結(jié)果是一致的。

2.4厚樸多酚類化合物對(duì)丙二醛（MDA）的影響

在脂質(zhì)過氧化過程中，MDA是重要代謝產(chǎn)物之一，是由細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸在受到輻射和OH直接作用時(shí)產(chǎn)生的。因此，MDA的數(shù)量變化可表示脂質(zhì)過氧化的程度，是判斷自由基損傷的重要指標(biāo)之一。

由表5可知，高劑量組、中劑量組以及VC對(duì)照組的MDA含量與空白對(duì)照相比，存在顯著性差異（P<0.05），只有低劑量組沒有顯著性差異。因此可以認(rèn)為厚樸多酚是有作用的。MDA的含量隨灌胃劑量的增加而減小，兩者之間存在一定的負(fù)相關(guān)性。此外，厚樸多酚中劑量組就達(dá)到了VC對(duì)照組中灌胃劑量100mg/kg的效果。由此表明：厚樸多酚類化合物有很好的抗氧化性。

2.5厚樸多酚類化合物對(duì)總超氧化物歧化酶（T-SOD）活性的影響

SOD作為體內(nèi)重要的抗氧化酶，主要是清除超氧陰離子自由基，若生物體內(nèi)SOD活力下降，就會(huì)引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，會(huì)對(duì)生物體造成很大的損傷。SOD對(duì)超氧陰離子自由基有專一性的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少。

由表6可知，低劑量組與空白對(duì)照組沒有顯著性差異，但是其他組均存在顯著性差異（P<0.05）。因此可以認(rèn)為厚樸多酚類化合物還是有提高SOD活力的作用的。此外，SOD活力隨灌胃劑量的增加而上升，兩者之間存在一定的正相關(guān)性。低劑量組與VC對(duì)照組相比，可以認(rèn)為VC對(duì)維持生物體SOD活力更佳。

2.6厚樸多酚類化合物對(duì)過氧化氫酶（CAT）活性的影響

由表7可知，中劑量組、高劑量組以及VC對(duì)照組與空白對(duì)照有顯著性差異（P<0.05）；高劑量組的活力大于中劑量組和低劑量組。灌胃劑量與活力數(shù)值呈正相關(guān)性，該結(jié)果與抑制羥自由基的能力得出的結(jié)論起到了相互補(bǔ)充的作用，而且兩者得出的結(jié)論相符。因此可以得出：厚樸多酚類化合物有起到體內(nèi)抗氧化作用。

2.7厚樸多酚類化合物對(duì)谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性的影響

GSH-PX是體內(nèi)重要的抗氧化酶，主要是清除體內(nèi)過氧化氫和有機(jī)氫過氧化物，并能夠特異地催化還原型谷胱甘肽對(duì)過氧化氫的還原反應(yīng)，起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用。由表8可知，高劑量組、中劑量組以及VC對(duì)照組的谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性比空白對(duì)照顯著提升（P<0.05）。對(duì)GSH-PX活力的影響可能是厚樸多酚類化合物自身發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，然后出現(xiàn)帶有電荷基團(tuán)，它們與過氧化氫以及有機(jī)氫過氧化物反應(yīng)，從而降低機(jī)體被氧化的風(fēng)險(xiǎn)，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力。也可能是因?yàn)楹駱愣喾釉跈C(jī)體內(nèi)刺激了谷胱甘肽過氧化物酶的生成，使體內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶含量增加，從而可以促進(jìn)過氧化氫與GSH反應(yīng)生成水及氧化型谷胱甘肽（GSSH），因此消耗掉機(jī)體內(nèi)的過氧化物。

3結(jié)論與討論

厚樸多酚類化合物的提取采用了超聲波提取法與浸提法，兩種方法所獲純化物的多酚含量分別是76.67%和64.11%。因此試驗(yàn)中采用了超聲波法提取厚樸多酚類化合物。

以KM小鼠為試驗(yàn)材料進(jìn)行體內(nèi)抗氧化試驗(yàn)，結(jié)果表明：一方面，KM小鼠血清中的蛋白含量比較接近，同時(shí)抑制羥自由基的能力和抗氧化活性成分（T-SOD、CAT、GSH-Px）的活性都有提升，說明KM小鼠的蛋白抗氧化能力得到了增強(qiáng)。另一方面，有害的成分（MDA）的含量有所降低，這有可能利于小鼠健康生長(zhǎng)。由此可見，厚樸多酚類化合物具有抗氧化性作用，并可能使動(dòng)物更健康生活，從而達(dá)到抗衰老的效果。