國蘭組培中外植體高效消毒方法研究

摘要：以湖南本地種的蕙蘭種子和春蘭新芽為外植體，以75%乙醇、0.1%升汞、10%次氯酸鈉為消毒劑設計了6個消毒方案進行外植體消毒試驗。結果表明：蕙蘭種子組織培養(yǎng)時采用75%酒精45 s+0.1%升汞消毒8rain的效果較佳，75%酒精45 s+0.1%升汞消毒5min對春蘭新芽組培滅菌效果較好；同時，升汞的消毒效果總體優(yōu)于次氯酸鈉，但需要掌握消毒時間，以免過度處理給外植體造成傷害導致其死亡。

關鍵詞：國蘭；外植體；組織培養(yǎng)；消毒

中圖分類號：Q813.1+2 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2018）03-0007-03

國蘭通常指蘭屬（Cymbidium）植物中具有較高觀賞價值的地生種蘭花，包括春蘭（C.goeringii）、建蘭（C.ensifolium）、蕙蘭（C.faberi）、寒蘭（Ckanran）、墨蘭（C.sinense）、蓮瓣蘭（Ctortisepalum）和春劍（C.tortisepalum var.longibracteatum）7個種類。蘭花香味清幽，花色淡雅，素有“花中君子”的美稱，觀賞價值、經濟價值和文化價值都非常高，深受人們喜愛。

由于蘭花種子極小且在自然條件下萌芽率極低，主要是通過分株進行繁殖。蘭花每年產生的新芽較少，分株繁殖系數低，而且速度較慢，無法滿足日益增長的市場需求。因此，組織培養(yǎng)技術成為國蘭生產中行之有效的快速繁殖方法。目前，我國部分蘭花試管苗及溫室大棚苗的產業(yè)化發(fā)展已初具規(guī)模，組培快繁的市場應用也正在全國各省市迅速發(fā)展。據相關統(tǒng)計，已有66屬蘭科植物通過組織培養(yǎng)方法進行繁殖，大大縮短了蘭花的生長周期，有效保護蘭屬植物種質資源，特別是珍貴瀕危的品種。雖然大部分蘭花組培快繁技術較為成熟，但是組織培養(yǎng)中還存在一些尚未徹底解決的問題，如外植體污染和玻璃化、褐化等，尤其外植體污染已成為國蘭組培是否成功的關鍵所在。研究以湖南本土國蘭不同部位的外植體為材料，通過對組織培養(yǎng)過程中消毒劑、時間、消毒方法的不同搭配設計了6個消毒方案，以期找出適宜不同部位外植體的有效消毒方法，為國蘭的快速繁殖技術提供參考。

1材料與方法

1.1試驗地點和材料

試驗在湖南省農業(yè)生物輻照工程技術研究中心組織培養(yǎng)研究室進行。試驗材料為蕙蘭種子和湖南本土下山春蘭新芽（選取完好無損、無病蟲害、帶基部的健康新芽）。供試消毒劑有乙醇、升汞、次氯酸鈉，均購自長沙隆和化玻實驗用品有限公司。

1.2試驗方法

通過文獻查閱，選用3種消毒試劑，分別是10%次氯酸鈉、0.1%升汞、75%乙醇，設置不同的消毒時間，共6個消毒試驗組合，分別為：處理1，75%乙醇45 s+0.1%升汞3min；處理2，75%乙醇45 s+0.1%升汞5min；處理3，75%乙醇45 s+0.1%升汞8min；處理4，75%乙醇45 s+10%次氯酸鈉10 min；處理5，75%乙醇45 s+10%次氯酸鈉15 min；處理6，75%乙醇45 s+10%次氯酸鈉20 min。外植體置于封閉容器中，分別將取得的種子和新芽按不同方法消毒后，用無菌水沖洗6～8次，然后接種于含有MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 3.0mg/L+活性炭2.0 g/L的培養(yǎng)基中；以種子作外植體時，每個蒴果接種10瓶，每瓶約500顆種子；以新芽為外植體時，每瓶接種1個新芽小段，每處理接種20瓶。15 d后統(tǒng)計污染情況。在光照強度2000Lx、光照時間12h/d的條件下培養(yǎng)。

1.3數據處理

試驗數據采用Microsoft Excel軟件進行數據處理。

2結果與分析

2.1不同消毒劑處理對蕙蘭種子消毒的效果

由表1可知，0.1%升汞消毒時間為3、5、8min，種子污染率分別為25%、15%、10%，表明采用0.1%升汞溶液對蕙蘭種子消毒，隨著滅菌時間的增加，污染率逐漸降低，效果較理想；10%次氯酸鈉的消毒時間為10、15、20 min，種子污染率分別為40%、25%、15%，表明10%次氯酸鈉對蘭花種子消毒效果與0.1%升汞溶液的趨勢相似，都是隨著處理時間的延長，消毒效果越好，污染率越低，但0.1%升汞溶液對蕙蘭種子的消毒效果要優(yōu)于10%次氯酸鈉。由于種子的萌發(fā)時間較長，檢測污染率時種子尚未萌發(fā)，因此未測出種子的死亡率。從以上結果分析可知，蕙蘭種子組織培養(yǎng)中宜采用75%酒精45 s+0.1%升汞消毒8min的消毒方式。

2.2不同消毒劑處理對春蘭新芽消毒的效果

從表2可以看出，0.1%升汞消毒時間分別為3、5、8 min，新芽污染率分別為40%、25%、15%，死亡率分別為40%、45%、65%，產生愈傷的新芽數量分別為2、3、1。這表明隨著處理時間的延長，0.1%升汞溶液對春蘭新芽的消毒效果越好，但與其對種子的消毒效果相比稍差一些，最高污染率為40%，最低為15%；同時，隨著消毒時間的延長，新芽的死亡率升高，最高達65%，原因可能是升汞毒性較大，當處理時間過長或沖洗不徹底時會造成外植體的死亡。10%次氯酸鈉的消毒時間為10、15、20 min，新芽污染率分別為55%、30%、25%，死亡率為60%、45%、60%。由此可知，10%次氯酸鈉對春蘭新芽消毒效果與0.1%升汞溶液消毒效果相似，即滅菌時間增加，污染率降低，但死亡率升高。整體來看，各處理的愈傷組織生長情況均不理想，出愈率低，原因可能是生長激素和細胞分裂素的濃度不適宜，同時誘導時間不夠導致的。綜合來看，以75%酒精45 s+0.1%升汞消毒5min對春蘭新芽組培滅菌效果相對較好。

3結論與討論

國蘭組織培養(yǎng)中比較棘手的問題就是外植體的污染，通常是微生物（細菌、霉菌、病毒）污染，這是影響蘭花組培苗成功出苗的重要指標之一。在蘭花組培過程中，多數為細菌污染，占總污染量的80%以上。細菌污染包括內生細菌污染、外生細菌污染。通常培養(yǎng)基、接種工具、外植體材料、接種員工違反操作規(guī)程等是外生細菌的主要來源，有人認為可能由于器具消毒不徹底，常帶有半致死性細菌構成組培中較常見的細菌性潛在污染；而內生細菌污染情況相對比較復雜，外植體材料本身可能攜帶細菌，因此在組織培養(yǎng)過程中選擇適宜的外植體材料、采用適宜的滅菌方法顯得尤為重要。

目前，針對蘭花組織培養(yǎng)技術的報道較多，于永暢等研究了以國蘭根尖、莖尖為組培外植體時的消毒方法，認為用75%乙醇浸泡30 s后，在10%次氯酸鈉中消毒20 min既能有效降低外植體污染率，又能保持較高成活率。而筆者的試驗結果表明，蕙蘭種子組織培養(yǎng)采用75%乙醇45 s+0.1%升汞消毒8min的效果較佳，75%乙醇45 s+0.1%升汞消毒5 min對春蘭新芽組培的滅菌效果較好。不同外植體的耐消毒劑能力不一樣，因此對國蘭組培外植體的消毒還要根據外植體不同選擇合適的消毒方法，以提高外植體的成活率。此外，試驗結果還表明，升汞的消毒效果總體優(yōu)于次氯酸鈉，但需要掌握消毒時間，以免消毒過度對外植體造成傷害導致其死亡。先用乙醇進行較為溫和的處理，可減少次氯酸鈉、升汞的處理時間，盡可能的減少外植體的死亡。

國蘭組織培養(yǎng)過程中受污染的概率較高，如何降低污染率，首先殺菌劑的選擇要適宜、消毒方法要正確，其次還要從其他各個操作過程中杜絕污染的發(fā)生。比如增加對接種工具及培養(yǎng)器皿的高壓滅菌時間；做好超凈工作臺和接種室的滅菌工作；盡量選取潔凈、無病蟲害、生長能力較強且不帶或少帶內生菌的材料為外植體；接種過程中嚴格遵守接種操作規(guī)程；在培養(yǎng)基內加入適量經過濾殺菌后的抗生素，可以有效降低外植體的污染率。