?玉米秸稈制備土壤生物修復(fù)劑及其應(yīng)用效果?

摘 要：針對(duì)溫室大棚內(nèi)土壤土傳病原菌多、農(nóng)藥殘留量高的特性，研制出了既能生物 降解農(nóng)藥殘留、又能生物防治土傳病害的生物修復(fù)劑。該菌劑以玉米秸稈為原料經(jīng)水熱處理后，固體發(fā)酵制成。采用室內(nèi)土壤降解試驗(yàn)，在菌劑加入量5 g/kg干土、多菌靈量為100 mg/kg干土?xí)r，滅菌土壤中的多菌靈8 d被完全降解，而自然土壤中的多菌靈被完全降解縮短到6 d，說明土著微生物和降解菌共代謝降解作用明顯。另外，還做了修復(fù)劑對(duì)黃瓜枯萎病的活體防效試驗(yàn)，防治效果達(dá)到81.7%，優(yōu)于化學(xué)農(nóng)藥。

關(guān)鍵詞：木霉;生物降解;水熱處理;多菌靈

中圖分類號(hào)：S156 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-060X（2018）01-0045-03

Preparation of Soil Bioremediation by Corn Stalk and its Application

TIAN Lian-sheng，CHEN Fei

（Yangzhou Polytechnic Institute， Yangzhou 225127， PRC）

Abstract：In order to solve these problems of more soil borne pathogens and and high pesticide residue in the greenhouse， a bioremediation agent was developed to the biodegradation of pesticide residue and biological control of soil-borne diseases. Using corn straw as the raw material， the agent was produced through hydrothermal treatment and solid fermentation. Adding 5 g/kg dry soil and 100 mg/kg carbendazim to it， the carbendazim in sterilized soil was degraded completely after 8 days by laboratory experiment of soil degradation where as the carbendazim in natural soil was degraded completely only after 6 days. The results showed that effect of co-metabolism and degradation of indigenous microorganisms and degrading bacteria was obvious. The control effect experiment on cucumber Fusarium wilt in vivo was conducted. The prevention effect was up to 81.7% and was more efficient than the chemistry pesticide.

Key words：Trichoderma; biodegradation; hydrothermal treatment; carbendazim

土傳病害是土壤中病原物侵染寄主植物所引起的一類植物病害。一般農(nóng)作物栽培3～4 a后土傳病原菌會(huì)越來越嚴(yán)重，對(duì)農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)、產(chǎn)量及生長造成影響，可使農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量下降20%～40%，情況嚴(yán)重的甚至絕收。近年來隨著農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，設(shè)施農(nóng)業(yè)發(fā)展迅速，溫室大棚栽培面積已達(dá)約270萬hm2。由于溫室大棚內(nèi)相對(duì)濕度和溫度較高，通風(fēng)環(huán)境較差，易于發(fā)生土傳病害，導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留較高、產(chǎn)量下降，嚴(yán)重制約了保護(hù)地栽培的可持續(xù)發(fā)展[1]。特別是近年來，我國的保護(hù)地栽培已經(jīng)進(jìn)入規(guī)?；a(chǎn)階段，這更為植物土傳病害在溫室大棚大規(guī)模發(fā)生創(chuàng)造了適宜環(huán)境和滋生條件[2]。采用多點(diǎn)取樣的方法，在同一地塊溫室大棚內(nèi)和大棚外分別采取土壤樣品，通過實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)并檢測(cè)出如下結(jié)果：棚內(nèi)土壤中，土傳病原菌數(shù)量是棚外3.2倍，其他微生物如細(xì)菌量減少了7.8倍，真菌量減少2倍，放線菌減少5倍，農(nóng)藥殘留量卻比棚外高了約6.7倍。可見溫室大棚內(nèi)土壤中病原菌大量孳生繁殖，導(dǎo)致其他有益微生物數(shù)量降低，嚴(yán)重破壞了土壤微生態(tài)平衡;另外，土傳病原菌的大量存在，也易引發(fā)病害頻繁發(fā)生，而農(nóng)民頻繁的噴藥防治，又增加了土壤和蔬菜中的農(nóng)藥殘留量，形成惡性循環(huán)。因此，降解土壤中的農(nóng)藥殘留，抑制土傳病原菌成為國內(nèi)外學(xué)者研究的重點(diǎn)[3-10]。

針對(duì)這一問題，揚(yáng)州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室分離、選育出能分解多菌靈等氨基甲酸酯類農(nóng)藥的降解菌T11和能有效抑制尖鐮孢菌（Fasariumsp.）、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）等土傳病原菌的生防菌T41，以玉米秸桿為原料，經(jīng)水熱處理后，通過混菌發(fā)酵制得土壤生物修復(fù)劑，該修復(fù)劑既能有效抑制土壤中的土傳病原菌，提高有益微生物數(shù)量，修復(fù)被破壞的生態(tài)環(huán)境;又可生物降解土壤中的農(nóng)藥殘留，使生產(chǎn)的農(nóng)產(chǎn)品達(dá)到綠色食品標(biāo)準(zhǔn)。以期從根本上解決溫室大棚產(chǎn)生的作物發(fā)病率高，農(nóng)產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留量大導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量和品質(zhì)下降的問題。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

木霉T11（Trichoderma spp.）降解菌株，實(shí)驗(yàn)室在農(nóng)藥廠倉庫土壤中分離、選育得到;木霉T41為實(shí)驗(yàn)室篩選的高效生防菌株;50%多菌靈可濕性粉劑（江蘇靖江農(nóng)藥廠提供）;纖維素復(fù)合酶（NS50013）（諾維信北京公司提供）;液體培養(yǎng)基：麩皮浸出液100 mL，（NH4）2SO4 0.2～0.4 g，K2HPO4 0.2～0.3 g，CaCO3 1 g，補(bǔ)加水至1 000 mL，調(diào)pH值至6.0～6.5;固體培養(yǎng)基：已預(yù)處理的稈粉10 g，葡萄糖0.7 g，（NH4）2SO4 0.4 g，KH2PO4 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.08 g，水30 mL，調(diào)pH值至6.0～6.5;PDA培養(yǎng)基：土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，水1 000 mL。

1.2 修復(fù)劑的制備

1.2.1 水熱預(yù)處理 把玉米秸稈干燥后，通過粉碎機(jī)將秸稈粉碎、篩分，篩選出粒徑約40目的部分備用。取10 g粉碎至40目玉米秸稈粉和200 mL去離子水，分別加入催化劑FeCl3 0.1、0.6、1.1、1.6和2.1 g，混合后加入到500 mL的反應(yīng)釜中，并密封反應(yīng)釜。檢測(cè)不同催化劑加入量下的木質(zhì)素溶出率。

（1） 第一級(jí)預(yù)處理。打開磁力攪拌和冷卻水閥門，攪拌器轉(zhuǎn)速調(diào)至250 r/min，打開電加熱裝置開始加熱。當(dāng)溫度到達(dá)160℃～170℃，保持恒溫20～22 min水解玉米秸稈中的半纖維素。一級(jí)預(yù)處理結(jié)束后，物料固液分離，固體相再進(jìn)行第二級(jí)處理;液項(xiàng)返回當(dāng)做水繼續(xù)使用。

（2）第二級(jí)預(yù)處理。一級(jí)處理后的固體10 g及200 mL去離子水，加入到500 mL 的反應(yīng)釜中，并密封反應(yīng)釜。當(dāng)溫度達(dá)到200℃時(shí)，恒溫20～25 min脫除木質(zhì)素，使處理過的玉米秸稈變得疏松。預(yù)處理反應(yīng)結(jié)束后，將物料固液分離，液項(xiàng)作為水循環(huán)使用，固體物料送至固體發(fā)酵裝置。

1.2.2 種子液制備 分別將木霉T11、T41接種在PDA培養(yǎng)基上，于25℃恒溫培養(yǎng)3 d，各挑取綠色分生孢子，接種到裝有100 mL液體培養(yǎng)基的三角瓶中，于200 r/min培養(yǎng)30～35 min，用血球計(jì)數(shù)板對(duì)孢子懸浮液計(jì)數(shù)，控制孢子濃度108 CFU/mL。

1.2.3 固體發(fā)酵 在250 mL三角瓶中放入10 g固體培養(yǎng)基，滅菌后以5%接種量接入1.3種子液和20 mL滅菌水，振蕩混勻后于25℃、保濕培養(yǎng)6 d，取樣干燥后用血球計(jì)數(shù)板測(cè)產(chǎn)孢量，當(dāng)分生孢子量達(dá)到1.0×1010 CFU/g時(shí)即可終止發(fā)酵，固體發(fā)酵物風(fēng)干后即為生物修復(fù)劑。

1.3 修復(fù)劑在滅菌土壤中的降解效果試驗(yàn)

在干燥箱中，把農(nóng)田土樣平鋪在盤中，在170℃干熱滅菌2 h。將100 mg多菌靈和5 g生物修復(fù)劑放到200 mL無菌水中混勻后，再與1 000 g滅菌土混勻，放入已高溫滅菌的花盆內(nèi)。將盆口用五層紗布包扎好，于25℃保溫、保濕處理，定期取樣測(cè)多菌靈含量[11]。另設(shè)100 mg多菌靈、5 g固體培養(yǎng)基和1 000 g滅菌土混合為對(duì)照處理，重復(fù)3次。

1.4 修復(fù)劑在自然土壤中降解效果試驗(yàn)

將多菌靈、修復(fù)劑和適量水混合，取折合1 000 g滅菌土的自然土混勻，按1.5方法與修復(fù)劑、多菌靈混合，調(diào)節(jié)含水量達(dá)20%。另設(shè)加入等量固體培養(yǎng)基、多菌靈和自然土混合為對(duì)照處理，重復(fù)3次。將盆土置于環(huán)境培養(yǎng)箱，在25℃、保濕放置，定期取土樣檢測(cè)多菌靈含量。

1.5 修復(fù)劑對(duì)黃瓜枯萎病防治效果試驗(yàn)

試驗(yàn)設(shè)3個(gè)處理：A，取修復(fù)劑5 g與2 000 g土壤混合后裝入盆內(nèi);B，取2 000 g土壤裝入盆內(nèi)，用50%速克靈可濕性粉劑500倍液15 mL/株灌根;C，取2 000 g土壤裝入盆內(nèi)作為對(duì)照。以上3盆分別移栽8株津青1號(hào)黃瓜苗。然后分別取15 mL尖鐮孢菌孢子懸浮液（105 CFU /mL）給黃瓜苗灌根。每處理4盆，重復(fù)3次。于25℃保濕栽培20 d，調(diào)查瓜苗發(fā)病情況，按公式（1）、（2）計(jì)算發(fā)病率和對(duì)枯萎病的防治效果。

發(fā)病率=感病株數(shù)/總株數(shù)×100% " " " " " " " " （1）

防治效果=（對(duì)照發(fā)病率-用藥發(fā)病率）/對(duì)照發(fā)病率×100% " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " "（2）

2 結(jié)果與分析

2.1 修復(fù)劑制備過程中催化劑用量

通過圖1可見，玉米秸稈熱水預(yù)處理過程中FeCl3對(duì)木質(zhì)素的溶出有很好的催化作用，隨著FeCl3用量的增加，木質(zhì)素溶出率快速提高，在1.6 g以后趨于穩(wěn)定。因此，催化劑加入量以1.6 g為宜。

2.2 修復(fù)劑在滅菌土壤中對(duì)多菌靈的降解效果

修復(fù)劑處理過的土樣中，降解菌T11對(duì)多菌靈降解非常迅速，第8 d時(shí)已檢測(cè)不到多菌靈殘留，基本被完全降解。而對(duì)照土壤中多菌靈自然降解速度緩慢，處理8 d時(shí)多菌靈僅降解了12.1 mg，12 d時(shí)也只被降解了21.3 mg。表明T11是一株性能優(yōu)良的降解菌株。由圖2可見：開始2 d內(nèi)降解速率稍慢，降解了26.9 mg多菌靈;但在隨后2 d內(nèi)降解速度加快，有45.5 mg多菌靈被降解;而第6～8 d時(shí)降解速度又變慢。這可能是降解菌分生孢子剛施入土壤，需要在土壤中定殖和繁殖，而隨著降解菌株大量繁殖，促進(jìn)了多菌靈的降解速率;隨著土壤內(nèi)營養(yǎng)成分減少，降解菌株的繁殖和代謝能力下降，降解能力也隨之減弱所致。

2.3 修復(fù)劑在自然土壤中對(duì)多菌靈的降解效果

自然土壤中的修復(fù)劑，對(duì)多菌靈降解速度比滅菌土壤快很多。處理6 d就可使多菌靈完全降解，比滅菌土完全降解縮短了2 d。而對(duì)照自然土壤中對(duì)多菌靈降解效果也比滅菌土快，處理12 d時(shí)，可降解多菌靈50.2 mg，而在滅菌土對(duì)照中12 d降解多菌靈只有21.3 mg。結(jié)果表明：無論是放入修復(fù)劑的處理，還是空白對(duì)照中，修復(fù)劑在自然土壤中對(duì)多菌靈降解效果均好于滅菌土處理。這可能是因?yàn)樽匀煌寥乐械耐林⑸锖徒到饩泊x降解作用，提高了對(duì)多菌靈的降解速率，縮短了降解時(shí)間。

2.4 修復(fù)劑對(duì)黃瓜枯萎病的防治效果

經(jīng)過15 d盆栽防效試驗(yàn)，生物修復(fù)劑和50%速克靈可濕性粉劑500倍液對(duì)黃瓜枯萎病的防治效果統(tǒng)計(jì)見表1。由表1可見：修復(fù)劑對(duì)黃瓜枯萎病防效達(dá)到81.7%，優(yōu)于速克靈的防治效果78.4%，且差異顯著。另外，處理15 d后田間觀察：修復(fù)劑處理的瓜秧粗大（平均株高高了1.2 cm），葉片深氯、肥大，表明修復(fù)劑對(duì)植物有一定的促生長作用。

3 結(jié) 論

（1） 加入1.6 g催化劑FeCl3，經(jīng)過二級(jí)水熱預(yù)處理，能有效水解玉米秸稈中的半纖維素，降解少量木質(zhì)素，破壞纖維素的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，從而提高玉米秸稈中纖維素的利用率。

（2）通過降解菌和生防菌混菌發(fā)酵，可制得分生孢子量達(dá)到1.0×1010 CFU/g的生物修復(fù)劑。

（3）生物修復(fù)劑在自然土壤中對(duì)多菌靈的降解效果優(yōu)于滅菌土，處理6 d就可使多菌靈完全降解，比滅菌土完全降解縮短了2 d。

（4）修復(fù)劑對(duì)黃瓜枯萎病防效達(dá)81.7%，優(yōu)于速克靈的78.4%防治效果，且差異顯著。

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