?水產(chǎn)品中氟喹諾酮類藥物殘留檢測技術(shù)研究進展?

摘 要：近年來，水產(chǎn)品中氟喹諾酮類藥物（Fluoroquinolone，簡稱FQs）殘留問題日益凸顯，為此國家針對FQs殘留制定了相應(yīng)的檢測標(biāo)準(zhǔn)。為了實現(xiàn)水產(chǎn)品中FQs殘留的快速高效檢測，從樣品前處理和檢測方法2個方面綜述了水產(chǎn)品中FQs殘留的檢測技術(shù)，以期為水產(chǎn)品中FQs殘留的監(jiān)測提供指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：水產(chǎn)品;氟喹諾酮類;檢測技術(shù);藥物殘留;綜述

中圖分類號：TS254.7 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-060X（2018）01-0115-04

Progress in Detection of Fluoroquinolone Residues in Aquatic Products

QIU Yu-jie，LI Xiao-yue，LI Bo-en，HE Jiang，YANG Pin-hong

（College of Life and Environmental Sciences， Hunan University of Arts and Science， Key Laboratory of Health Aquaculture and Product Processing in Dongting Lake Area of Hunan Province， Cooperative Innovation Center of High Efficient and Healthy Production of Aquatic Products in Hunan Province， Changde 415000， PRC）

Abstract：In recent years， the residues of fluoroquinolones （Fluoroquinolone， FQs） in aquatic products are becoming more and more serious. Therefore， the country has formulated corresponding testing standards for FQs residues. In order to achieve rapid and efficient detection of FQs residues in aquatic products， the detection technology of FQs residues in aquatic products was reviewed from 2 aspects， including sample pretreatment and detection methods， and to provide guidance for monitoring FQs residues in aquatic products.

Key words：aquatic products; fluoroquinolones; detection techniques; drug residues; review

水產(chǎn)品作為蛋白質(zhì)食物的主要來源，在城鄉(xiāng)居民的食品消費結(jié)構(gòu)中占有十分重要的地位。近年來，隨著我國居民收入水平的提高，以低脂肪、高蛋白為主要特征的水產(chǎn)品人均消費量和消費比例不斷擴大。以湖南省水產(chǎn)品消費情況為例，從1995～2014年，湖南省水產(chǎn)品消費總量從5.32 kg/人增長到了10.79 kg/人，水產(chǎn)品占肉類消費比例從21.05%增長到了22.99%。預(yù)計未來幾年中國水產(chǎn)品的人均消費將持續(xù)增長，這無疑對水產(chǎn)品的質(zhì)量安全問題提出更進一步的要求[1]。

氟喹諾酮類藥物（Fluoroquinolone，簡稱FQs）是4-Quinolone結(jié)構(gòu)改造衍生物，其共同特點是喹啉環(huán)（個別為萘啶環(huán)）的C-6位上有一個氟原子，C-7位上連接哌嗪基或吡咯基（圖1），具有抗菌譜廣、抗菌作用強、蛋白結(jié)合率低、使用方便及價格低廉等特點[2-3]。它屬于第三代喹諾酮類藥物，是近期迅速發(fā)展起來的一類非常重要的人工合成抗菌藥物。作為一種廣譜抗菌藥物，該藥物對G+、G-、支原體和衣原體均有殺菌作用，其中氧氟沙星、氟羅沙星等被廣泛用于畜牧、水產(chǎn)等養(yǎng)殖業(yè)中，預(yù)防并治療畜禽和魚類各種感染性疾病。

隨著FQs的廣泛應(yīng)用，其殘留問題也隨之而來。在食品生產(chǎn)各環(huán)節(jié)由于專業(yè)知識缺乏、片面追求經(jīng)濟利益等造成的藥物過量使用可導(dǎo)致FQs通過食物鏈進入人體，引起食用者腸道菌群失衡甚至癌變[4]。許多國家和組織對其使用進行了限制。例如歐盟已禁止諾氟沙星、環(huán)丙沙星在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中使用;美國禁止在食用動物養(yǎng)殖中使用FQs;我國于2002年規(guī)定了環(huán)丙沙星、恩諾沙星等7種QNs藥物在動物肌肉組織中的最大殘留限量（MRLs）為 10～500 μg/kg;2015年我國國家農(nóng)業(yè)發(fā)布公告禁止洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星4 類FQs抗生素在食用動物中的使用。FQs殘留檢測越來越成為當(dāng)今研究的重點。因此，筆者針對水產(chǎn)品中FQs殘留的前處理及檢測分析方法進行綜述，以期為FQs殘留檢測提供指導(dǎo)。

1 水產(chǎn)品中氟喹諾酮類藥物殘留前處理方案研究概況

前處理通常包括提取、凈化和濃縮3個過程，其中濃縮常以減壓蒸餾、氣流（N2）吹蒸和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)這3種方式除去溶劑使樣品溶液濃度達到檢測儀器要求。QuEChERS作為一種新型的快速樣品前處理技術(shù)也被逐漸應(yīng)用在FQs殘留檢測中。筆者主要介紹了樣品提取、凈化以及新型QuEChERS前處理技術(shù)在水產(chǎn)品中FQs殘留檢測中的應(yīng)用。

1.1 樣品提取

樣品提取關(guān)鍵在于提取溶劑、提取量和提取時間這3個方面?？紤]到樣品均勻度、提取溶劑和樣品間的相溶度以及提取劑的成本等因素，樣品提取時一般取1～5 g樣品，每1 g樣品約需用5～10 mL的提取劑，多次重復(fù)提取，提取過程中通常伴有高速勻質(zhì)、機械振蕩或超聲波等輔助措施。

FQs是極性化合物，易溶于極性和水溶性有機溶劑、稀酸和堿溶液，不溶于非極性溶劑，且樣品基質(zhì)為水產(chǎn)品，蛋白質(zhì)含量高。提取溶劑需在提取FQs的基礎(chǔ)上對基質(zhì)蛋白進行沉淀，以便讓提取液雜質(zhì)相對較少，才有利于后續(xù)的凈化。由于FQs在乙腈中較強的溶解能力以及酸性條件對FQs提取率的影響，常用的提取溶劑一般為可以沉淀蛋白質(zhì)的乙腈與酸的混合溶液，如甲酸-乙腈溶液、乙酸-乙腈溶液、磷酸鹽-乙腈溶液等[5-6]。

隨著國內(nèi)外學(xué)者的進一步研究，這些傳統(tǒng)提取劑被發(fā)現(xiàn)存在一些弊端。例如：由于FQs與蛋白質(zhì)結(jié)合作用較強，使用傳統(tǒng)提取劑提取時樣品蛋白質(zhì)易快速沉淀，會造成待測物包裹損失，且有機溶劑會對環(huán)境造成不良影響。針對這一問題，一些新型的提取試劑開始逐漸被人們發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用。李桂芝等[7]發(fā)現(xiàn)弱酸水溶液也可使蛋白質(zhì)變性沉淀，利用合適濃度的檸檬酸水溶液作為生物親和提取液進行提取并結(jié)合HPLC進行檢測，檢出限為0.005 5～0.016 0 mg/kg，證明該類提取試劑的確提高了提取效率。除此之外，對檢測影響較小的新型提取試劑還有磺基水楊酸[8]。何碧英等[9]在試驗中發(fā)現(xiàn)樣品在提取過程中需避光，否則待測物會見光分解。

1.2 樣品凈化

目前，F(xiàn)Qs的凈化方法主要為液-液萃取（LLE）和固相萃?。⊿PE），具體試驗中需依據(jù)樣品基質(zhì)和提取溶劑來選擇適宜的凈化方法。

LLE是經(jīng)典的萃取方法。該方法操作簡單，但是使用的溶劑量較大且容易出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，在樣品量大的情況下不太適用。由于水產(chǎn)品基質(zhì)中含有大量脂肪，通常選用乙腈飽和的正己烷液進行凈化除雜，以消除脂肪等大部分弱極性雜質(zhì)對檢測結(jié)果的干擾[10]。

近年來常使用固相萃?。⊿PE）進行凈化。FQs殘留檢測中使用較多的是C18或C8的反相柱，離子交換柱（SCX、PRS）和聚合物基質(zhì)的SPE柱（HLB）也有使用。SPE所需溶劑少，不產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，通常用于極性或緩沖溶液提取后，缺點是價格較高且操作繁瑣耗時，并不適用于快速大批量檢測。

此外，也可采用基質(zhì)固相分散萃?。╠SPE）、超臨界流體萃取、固相微萃取、加速溶劑萃取和分子印跡固相萃取等方法凈化樣品。李佩佩等[11]采用dSPE-UPLC-MS/MS同時檢測水產(chǎn)品中14種喹諾酮類藥物，檢出限為0.4～1.0 μg/kg，定量限為1.0～3.0 μg/kg。

1.3 新型QuEChERS前處理技術(shù)

QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe），是近年來國際上最新發(fā)展起來的一種用于農(nóng)產(chǎn)品檢測的快速樣品前處理技術(shù)，由美國農(nóng)業(yè)部Anastassiades 教授等于2003年開發(fā)。其原理與高效液相色譜（HPLC）和固相萃?。⊿PE）相似，都是利用吸附劑填料與基質(zhì)中的雜質(zhì)相互作用，吸附雜質(zhì)從而達到除雜凈化的目的。在FQs殘留檢測中采用該法進行預(yù)處理時通常選用乙腈（酸性乙腈）進行提取，適當(dāng)離心后加入分散固相萃取劑（C18、PSA等）混勻，離心后靜置片刻即可取上清液稀釋待測。QuEChERS法和其所涉及的相關(guān)技術(shù)正逐漸被大多數(shù)實驗室所采用。陳國棟[12]、Lombardo-Agüí等[13]國內(nèi)外學(xué)者用此方法對比傳統(tǒng)樣品前處理方法，結(jié)合UPLC-MS/MS、UPLC對水產(chǎn)品中FQs殘留進行檢測分析，結(jié)果證實該方法較傳統(tǒng)前處理方法更為快速高效，顯示出其在復(fù)雜的矩陣中進行常規(guī)分析的靈敏度和適用性，是一種實用性很好的前處理方法。

2 水產(chǎn)品中氟喹諾酮類藥物殘留檢測方法研究概況

常見的水產(chǎn)品FQs殘留檢測方法有HPLC法、LC-MS法、微生物抑制法、酶聯(lián)免疫法、高效毛細管電泳分析法等，其中HPLC法和LC-MS法應(yīng)用較為廣泛。筆者主要介紹水產(chǎn)品中FQs藥物殘留檢測的HPLC法和LC-MS法，并對其他幾種檢測方法進行簡要敘述。

2.1 高效液相色譜法（HPLC）

HPLC法是在水產(chǎn)品FQs殘留檢測中應(yīng)用較廣的一種檢測方法，該法也多被用于國家標(biāo)準(zhǔn)。建立一種HPLC分析方法需要確定色譜柱、流動相、柱溫和進樣量、檢測器這4個色譜條件。

2.1.1 色譜柱的選用 FQs結(jié)構(gòu)中同時包含有哌嗪基和羧基，在水中解離常會導(dǎo)致色譜柱填料表面殘留的硅醇基（硅羥基）和金屬雜質(zhì)通過氫鍵或離子交換作用強烈吸附FQs，造成色譜峰拖尾、峰形異常和分離度下降等現(xiàn)象，因此FQs殘留分析多采用以高純硅膠為基質(zhì)并經(jīng)端基封閉處理的色譜柱，如C18、C8柱、苯基柱，其中C18柱等反相色譜柱在FQs檢測中應(yīng)用較為廣泛，非硅膠基質(zhì)的聚合物柱也有應(yīng)用[14]。

2.1.2 流動相及其相關(guān)條件的確定 FQs殘留色譜檢測中流動相一般由有機試劑（通常為乙腈）、酸性溶液和離子對試劑3部分按一定比例組成。研究發(fā)現(xiàn)，流動相種類是影響FQs保留時間的主要因素，在流動相中添加緩沖鹽可以有效改善因保留時間漂移而引起的對可能陽性樣品的錯誤判斷，而在其中加入離子對試劑（四丁基溴化銨、乙酸銨等）可改善FQs的色譜峰拖尾現(xiàn)象，提高分離度[15-16]。流動相的pH值也對FQs的分離效果產(chǎn)生較大影響，過低的pH值會導(dǎo)致保留時間延長，且影響色譜系統(tǒng)的壽命，F(xiàn)Qs殘留色譜檢測中流動相的pH值常在2.0～3.0范圍內(nèi)。

2.1.3 柱溫和進樣量的確定 適當(dāng)提高柱溫可以降低流動相的黏度從而確保色譜分離效果，但柱溫也不宜過高以免對色譜柱的壽命造成不利影響。適當(dāng)增加進樣量也可以提高分析方法的靈敏度，但這需要根據(jù)具體的試驗情況來確定。在FQs液相色譜檢測中，通常柱溫設(shè)置在30～40℃，進樣量范圍在0.2～1.0 μL之間較為適宜。

2.1.4 檢測器及其相關(guān)參數(shù)的確定 FQs具有較強的紫外吸收和熒光性質(zhì)，因此水產(chǎn)品中FQs殘留檢測常采用紫外-可見光檢測器（UVD）和熒光檢測器（FLD）2種檢測器。UVD靈敏度相對較低，在FQs殘留HPLC中檢測波長通常為254～280 nm;FLD的靈敏度較UVD高出2～3個數(shù)量級，是最靈敏的液相色譜檢測器。由于FQs分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，含有哌嗪環(huán)的絕大部分FQs和小部分不含哌嗪環(huán)的FQs的熒光光譜特性不同，對于FQs多殘留檢測采用程序波長法可提高檢測靈敏度和選擇性。

2.2 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）

由于磷酸鹽為非揮發(fā)性鹽，不適用于質(zhì)譜的分析，所以LC-MS法檢測FQs藥物殘留時提取劑多為酸性乙腈溶液（2%甲酸乙腈等），也有采用0.1 mol/L乙酸銨緩沖液-乙腈溶液進行提取的。因為FQs種類多，為了達到不同藥物的最佳檢測條件，LC-MS的流動相多為0.1%甲酸水溶液-乙腈（甲醇、0.1%甲酸乙腈），并

均采用梯度洗脫程序。離子源和離子檢測模式一般采用電噴霧電離（ESI）和多離子檢測模式（MRM）[17-18]。

選取部分相關(guān)文獻[19-24]進行統(tǒng)計，結(jié)果如表1所示。由表1可知，LC-MS法較HPLC法檢出限低、靈敏度好且更為穩(wěn)定，較好地體現(xiàn)出了該方法能夠?qū)崿F(xiàn)多殘留高靈敏度快速檢測的優(yōu)勢。二級質(zhì)譜（LC-MS/MS）和多級質(zhì)譜（三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜）等革新技術(shù)也逐漸被應(yīng)用于水產(chǎn)品FQs殘留檢測領(lǐng)域。王麗娟等[25]比較了HPLC和HPLC-MS/MS這2種方法在水產(chǎn)品FQs殘留檢測中的效果，發(fā)現(xiàn)HPLC-MS/MS法檢測靈敏度高于HPLC，HPLC法可作為水產(chǎn)品中FQs殘留檢測的初步篩檢方法，而HPLC -MS/MS法能準(zhǔn)確定量水產(chǎn)品中FQs含量。

2.3 其他檢測方案

除了HPLC和LC-MC這2種應(yīng)用較廣泛的檢測方法外，水產(chǎn)品中常見的FQs殘留檢測方法還有微生物法、酶聯(lián)免疫法（ELISA）、高效毛細管電泳分析法等，每種方法都各有其優(yōu)缺點，需要根據(jù)不同的目的和要求篩選合適的方法[26-27]。

微生物法是利用對FQs敏感菌株的抑菌效果來檢測水產(chǎn)品中抗生素殘留的一種方法，適用于快速篩選，但該方法靈敏度較差，檢測限較高。高效毛細管電泳分析法不受運行緩沖液的酸堿性和表面活性劑等添加劑的影響，操作簡單、樣品用量少且分析速度快，但其檢測限同樣也頗高，不適用于含量微小的物質(zhì)殘留檢測。ELISA是一種基于抗原抗體之間特異性結(jié)合反應(yīng)的分析技術(shù)，不需要配備昂貴儀器、無復(fù)雜的樣品前處理步驟，且檢測快速靈敏。但目前該方法檢測限不統(tǒng)一且檢測結(jié)果判定較為困難，適用于大量樣品的初步快速篩選。楊金易等[28]建立了水產(chǎn)品中3種FQs多殘留的ELISA法，同時結(jié)合了新型QuEChERS前處理技術(shù)，其檢出限為0.008 7 μg/kg，表明ELISA法適合FQs多殘留檢測，并可應(yīng)用于生產(chǎn)實踐。

3 展 望

水產(chǎn)品中FQs殘留問題不容忽視，其檢測方法多種多樣、各有優(yōu)缺點，預(yù)測今后FQs殘留檢測技術(shù)將向著具備高靈敏度的聯(lián)用技術(shù)、適用大規(guī)?？焖俸Y選的免疫檢測技術(shù)以及復(fù)雜基質(zhì)中多殘留組分同時檢測技術(shù)3個方向發(fā)展。而鑒于HPLC法在應(yīng)用程度和靈敏度之間存在矛盾，因此在其基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，以更高壓力、更小直徑顆粒為柱填料的技術(shù)可以使檢測目標(biāo)獲得更高效快速的分離。例如降低了分析成本的UPLC法將逐漸替代傳統(tǒng)HPLC法，同時UPLS-MS在FQs多組分殘留檢測中也將發(fā)揮重要作用。

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