?高產(chǎn)色素低產(chǎn)桔霉素紅曲霉菌株的篩選、鑒定和抑菌性分析?

摘 要：從各地收集的樣品中分離純化獲得235株紅曲霉菌株。采用分光光度法測定菌絲紅曲色素的色價，高效液相色譜法（HPLC）測定發(fā)酵液中桔霉素含量，篩選獲得1株高產(chǎn)色素低產(chǎn)桔霉素的紅曲霉M-92菌株，經(jīng)鑒定為紫色紅曲霉（Monascus purpureus）。用紅曲霉M-92菌株作菌種制備紅曲米，按GB 4926—2008方法測定紅曲米色價，可達2 138 U/g。用牛津杯法測定紅曲米粉對4種單細胞微生物的抑制效果，抑菌強弱順序依次為：金黃色葡萄球菌>枯草芽孢桿菌>白色念球菌>大腸桿菌;用生長速率法測定紅曲米粉對5種植物病原真菌的抑制效果，根據(jù)半最大效應濃度EC50的大小，抑菌強弱順序依次為：番茄早疫病菌>白絹病菌>黃瓜枯萎病菌>赤霉菌>苦瓜枯萎病菌。

關(guān)鍵詞：紅曲霉;紅曲色素;桔霉素;篩選;抑菌性

中圖分類號：Q93 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2018）01-0001-06

Screening and Identifying Monascus Strain of Higher-yield Pigment and Lower -yield citrinin and Its Antibacterial Activity

MAREY Rehab，GU Jia-huan，XU Chu-xuan，JIANG Dong-hua

Abstract：235 Monascus strains were isolated from various Monascus fermentation products. A Monascus strain M-92 which produces higher Monascus pigment and lower citrinin was screened out. Studies on ITS sequence and morphology characteristics showed that the strain M-92 belongs to Monascus purpureus. Pigment yield of red kojic rice prepared with strain M-92 reached 2138 U/g determined by GB 4926-2008 method. Inhibitory effects of Monascus rice powder to four single-celled microorganisms were determined by the oxford cup method. The results showed that antibacterial activities in the order were Staphylococcus aureusgt;Bacillus subtiligt;Candida albicansgt;Escherichia coli. Inhibitory effects of Monascus rice powder to five phytopathogenic fungi were determined by growth rate method. The results indicated that inhibitory activities in the order by EC50 were Alternaria solanigt;Sclerotium rolfsiigt;Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinumgt;Gibberella fujikuroigt;Fusarium oxysporum f. sp. momordicae. The results in this paper have a certain theoretical and practical significance to development and utilization of Monascus resources.

Key words：Monascus; pigment; screening; citrinin; antibacterial activity

紅曲霉（Monascus）是我國傳統(tǒng)的食用和藥用絲狀真菌。紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物紅曲色素是一種天然色素，具有廣闊的市場前景[1-2]。有報道表明紅曲色素不僅具有降血脂和消炎的功效，還能抑制肝細胞脂肪酸的積累;Zheng等[1]研究表明紅曲色素有望成為新型的抗腫瘤和治療肥胖癥的藥物或保健品。鄭虹等[3]用紅曲霉發(fā)酵提取液對指示菌進行了抑菌性試驗，結(jié)果表明紅曲色素具有較強的抑菌活性。但是，紅曲霉某些菌株也會產(chǎn)生對人體有害的真菌毒素——桔霉素（citrinin）[4-5]。在工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)紅曲色素過程中普遍存在著菌株退化、產(chǎn)量偏低、發(fā)酵工藝單一等問題，發(fā)酵過程中桔霉素的產(chǎn)生也限制了紅曲霉的工業(yè)應用[6-7]。紅曲色素作為一種天然色素，具有色調(diào)好，蛋白著色力強，安全無副作用等優(yōu)點，同時還具有防腐功效，能有效抑菌和抗氧化，延長食品保質(zhì)期[2]。因此，篩選高產(chǎn)色素低產(chǎn)桔霉素紅曲霉菌株，分析色素的抑菌性，對我國醫(yī)藥保健和食品工業(yè)的發(fā)展具有重要意義[6-7]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌 種 （1）紅曲霉菌株：從各地收集紅曲米、紅腐乳、紅曲酒等樣品，分離、篩選、純化獲得的紅曲霉各菌株。（2）4種單細胞微生物：金黃色葡萄球菌

（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、

白色念球菌（Canidia albicans）、大腸桿菌（Escherichia coli）。（3）5種植物病原真菌：番茄早疫病菌（Alternaria solani）、白絹病菌（Sclerotium rolfsii）、黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. cucumerium）、小麥赤霉病菌（Gibberella fujikuroi）苦瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum"f. sp. momordicae）。

1.1.2 主要培養(yǎng)基 （1）PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯20%，

葡萄糖2%，瓊脂2%，pH 6.0。（2）PD培養(yǎng)液：馬鈴薯20%，葡萄糖2%，pH 值6.0。（3）色素發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖10%，蛋白胨3%，K2HPO4 1%，MgSO4·7H2O 0.05%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001%，KCl 0.005%，NaNO3 0.2%，pH值5.8。（4）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，瓊脂2%，pH值7.2～7.4。用于細菌的培養(yǎng)。

1.1.3 秈 米 秈米購自浙江省金華市農(nóng)貿(mào)市場，用于紅曲米的制備。

1.2 試驗方法

1.2.1 紅曲霉菌株的分離純化與保藏 將各地收集的紅曲米樣品分別接種于PDA培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)5～7 d，取單菌落經(jīng)3次純化得到純菌株，編號保存。

1.2.2 高產(chǎn)色素紅曲霉菌株的篩選 紅曲霉各菌株P(guān)DA培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)5 d，用6 mm的打孔器取3個菌餅接入50 mL（250 mL三角瓶）色素發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min培養(yǎng)7 d。取發(fā)酵液進行抽濾，得到菌絲，烘干。參考臧晉等[5]方法提取紅曲色素，測定色素色價。菌絲色價測定：稱取干菌絲0.05 g，加10 mL 70%乙醇溶液，60℃水浴1 h，12 000 r/min離心15 min，取上清液分光光度法測OD505值。計算各紅曲霉菌株菌絲的色價，篩選出高產(chǎn)色素的紅曲霉菌株。

按公式（1）計算色素色價：色素色價=吸收峰處OD505值×稀釋倍數(shù)×20 " （1）

1.2.3 低產(chǎn)桔霉素紅曲霉菌株的篩選 取發(fā)酵液（包括菌絲）1 mL，用等量提取液（甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸=

7∶3∶1）提取桔霉素，4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液保存?zhèn)溆?。HPLC檢測桔霉素方法：有

機相（A）為乙腈（色譜純），水相（B）為pH 值2.5的磷酸水溶液。Agilent TC-C18液相色譜柱（250×4.6 mm，5 μm），A∶B=75%∶25%，檢測波長：λ=331 nm，

流速：1 mL/min，柱溫：30℃。分別配制1、10、20、40和50 mg/L的桔霉素標準品溶液，繪制桔霉素標準曲線[8]。

1.2.4 高產(chǎn)色素低產(chǎn)桔霉素紅曲霉目的菌株的鑒定 紅曲霉菌株P(guān)DA上培養(yǎng)7 d，提取基因組DNA。擴增ITS rDNA基因，送上海生物工程公司測序。觀察紅曲霉目的菌株在PDA培養(yǎng)基上菌落形態(tài)、顯微結(jié)構(gòu)，ITS rDNA在GenBank的核酸序列庫中分析同源性，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定紅曲霉目的菌株的分類地位。

1.2.5 紅曲米的制備 取PDA平板上活化培養(yǎng)3 d的直徑為6 mm的紅曲霉菌餅3個，接入PD培養(yǎng)液中（裝50 mL/250 mL三角瓶），30℃、180 r/min搖床培養(yǎng)3 d，發(fā)酵液用作紅曲米制備的發(fā)酵種子。大米（秈米）浸泡過夜，瀝干，稱30 g分裝于250 mL

三角瓶中，121℃滅菌20 min，冷卻后，每瓶接入3 mL上述種子液。30℃培養(yǎng)12 d，烘干，得紅曲米成品[9]。

1.2.6 紅曲米中紅曲色素的提取和色價的測定 按GB 4926—2008方法提取和測定紅曲色素，稱取紅曲米0.200 g（m），放入帶刻度的100 mL具磨口塞試管中，加入70%乙醇，搖勻后放入60℃水浴保溫萃取1 h，冷卻并定容，用普通定性濾紙過濾入具塞試管中。吸取1 mL濾液放入25 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至25 mL。以70%乙醇作空白對照，在分光光度計上（波長505 nm）測定樣品萃取稀釋液的吸光度A。

按公式（2）計算紅曲米樣品色價：

X=A×100/m×25 " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " "（2）

式中：X—紅曲米樣品的色價，U/g;A—樣品萃取稀釋液吸光度;m—稱取紅曲米樣品的質(zhì)量，g。

1.2.7 紅曲色素抑菌性分析 （1）對4種單細胞微生物抑制作用的測定：分別稱取1.0 g上述紅曲米成品，研磨成粉，用丙酮配成濃度分別為10.00、5.00、2.50和1.25 mg/mL的紅曲色素丙酮溶液，放置在4℃冰箱避光保存?zhèn)溆?。用牛津杯法[10]測定不同濃度紅曲色素對4種細菌單細胞微生物的抑制作用。用移液器吸取濃度為1×107 CFU/mL的細菌懸液1 mL至牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)平板上，用無菌L型玻棒涂布均勻后，用鑷子將無菌的牛津杯輕輕放入培養(yǎng)皿中，水平放置5 min后，分別吸取一定濃度的紅曲色素丙酮溶液0.2 mL至牛津杯中，空白對照組中添加丙酮溶液。將培養(yǎng)皿放置于37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。采用十字交叉法測定各濃度紅曲色素下的抑菌圈直徑。（2）對5種植物病原真菌抑制作用的測定：用生長速率法測定不同濃度紅曲色素抑菌活性。配制紅曲色素濃度分別為1.000、0.500、0.250和0.125 mg/mL的PDA培養(yǎng)基。將供試植物病原真菌PDA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)3 d，用打孔器邊緣取菌餅（直徑8 mm）置于含不同濃度紅曲色素PDA培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)5～

7 d，每隔1 d測量菌落直徑，計算半最大效應濃度EC50（mg/mL）。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)色素低產(chǎn)桔霉素紅曲霉菌株的分離純化與篩選

通過分離純化共獲得235株紅曲霉菌株，紅曲霉代表性菌株典型菌落形態(tài)見圖1，加入25%甘油后保藏于-20℃冰箱中，備用。

分光光度法測定了235株紅曲霉菌株菌絲的色價（圖2）;不同紅曲霉菌株菌絲的色價存在顯著差異，色價范圍為50 ～628.9 U/g，92號紅曲霉菌株紅曲色素色價最高，達628.9 U/g。

以一系列不同桔霉素標準品質(zhì)量濃度為橫坐標，HPLC法測定的桔霉素峰面積為縱坐標，繪制桔霉素標準曲線如圖3，桔霉素的標準曲線為：y=251.4x+244.4，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8。

圖3 桔霉素的標準曲線

根據(jù)標準曲線計算紅曲霉各菌株發(fā)酵液桔霉素含量（圖4）。不同紅曲霉菌株發(fā)酵液的桔霉素含量存在顯著差異，桔霉素含量范圍為0～7.13 mg/L，92號紅曲霉菌株發(fā)酵液中的桔霉素較低，為1.01 mg/L，相對較為理想。后續(xù)實驗選取92號（編號為：M-92）紅曲霉菌株為材料。

2.2 紅曲霉M-92菌株的分類鑒定

紅曲霉M-92菌株P(guān)DA上30℃培養(yǎng)10 d，觀察菌落形態(tài)及顯微結(jié)構(gòu)。M-92菌株氣生菌絲絨毛狀，橘紅色，有隔膜和色素顆粒;分生孢子橢球形;閉囊殼球形;囊內(nèi)孢子可見，子囊孢子橢球形（圖5）。

紅曲霉M-92菌株ITS rDNA基因PCR擴增和測序的結(jié)果（527 bp）如圖6，基于ITS rDNA基因序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖7，根據(jù)紅曲霉M-92菌株形態(tài)特征，結(jié)合李鐘慶和郭芳紅曲霉分種檢索表[11]和ITS rDNA基因序列，鑒定M-92菌株為紫色紅曲霉（Monascus purpureus）。

2.3 M-92菌株制備紅曲米及其色價

用紅曲霉M-92菌株作菌種制備紅曲米，按GB 4926—2008提取、測定、計算紅曲米的色價，結(jié)果表明紅曲霉M-92菌株制備的紅曲米色價可達2 138 U/g。

2.4 紅曲米粉的抑菌性分析

2.4.1 對4種單細胞微生物抑制作用 由表1和圖8可知，對照丙酮溶液對上述4種單細菌微生物生長均無抑制作用;對于各濃度的紅曲米粉丙酮溶液，從總體效果來看，隨著色素濃度的降低，抑菌圈直徑也隨之縮小。抑菌效果的順序依次為：金黃色葡萄球菌gt;枯草芽孢桿菌gt;白色念球菌gt;大腸桿菌。

2.4.2 對5種植物病原真菌的抑制效果 由表2和圖9可知，紅曲色素對測試的5種植物病原真菌均具有一定的抑制作用，其中對番茄早疫病菌和白絹病菌的抑制效果較好，而對赤霉菌、苦瓜枯萎病菌的抑制效果就相對較差。根據(jù)半最大效應濃度EC50的大小，抑菌效果的順序依次為：番茄早疫病菌gt;白絹病菌gt;黃瓜枯萎病菌gt;赤霉菌gt;苦瓜枯萎病菌。

3 結(jié)論與討論

試驗從紅曲制品中分離純化獲235株紅曲霉菌株，篩選獲1株紅曲色素產(chǎn)量較高、桔霉素產(chǎn)量較低的紅曲霉M-92菌株。經(jīng)鑒定M-92菌株為紫色紅曲霉。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)7 d，紅曲霉M-92菌株菌絲紅曲色素色價可達628.9 U/g，桔霉素含量較低為1.01 mg/L，紅曲霉M-92菌株作菌種發(fā)酵12 d制備紅曲米，色價可達2 138 U/g。

用牛津杯法測定紅曲米粉對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念球菌、枯草芽孢桿菌4種單細胞微生物的抑菌作用，結(jié)果紅曲米粉對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌抑菌效果較好;測定紅曲米粉對5種植物病原真菌抑制作用，結(jié)果紅曲米粉對番茄早疫病菌和白絹病菌的抑菌效果較好。

紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)品在食品儲藏與防腐中的作用，一直是食品加工行業(yè)的焦點，紅曲色素的抑菌性研究也逐漸深入，張偉等[10]采用硅膠柱層析法對紅曲色素中紅曲紅、紅曲橙、紅曲黃3種色素進行分離，分別測定了這3種組分對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑制作用，結(jié)果表明橙色組分抑菌性最強。試驗用紅曲米粉測定對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌、番茄早疫病菌和白絹病菌等均有較強的抑制作用。本研究結(jié)果對紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)品在食品儲藏、防腐和加工上的應用具有較好的指導意義[12]。

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