?響應面法優(yōu)化楊梅果渣花色苷微波輔助提取工藝

摘 要：為優(yōu)化楊梅果渣花色苷提取工藝，在單因素試驗基礎上，采用響應面法研究微波輔助提取法對花色苷提取率的影響。結果表明：回歸模型擬合度高（R2=0.969 2），且失擬誤差不顯著（P=0.133 6）。試驗因素對提取楊梅果渣花色苷的影響程度為：乙醇濃度>料液比>微波功率>提取時間。最優(yōu)提取工藝條件是：乙醇體積分數(shù)為80%、料液比為1∶25 g/mL、微波功率為510 W、提取時間為5 min，最優(yōu)工藝條件下提取量為9.02 mg/g。

關鍵詞：楊梅果渣;花色苷;響應面;微波輔助提取

中圖分類號：TS209 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2018）11-0089-06

Optimization of Microwave-assisted Extraction Process for Anthocyanins from Bayberry Residue by Response Surface Methodology

LIU Jie1，LI Huan1，2，ZHANG Ju-hua1，2，LI Gao-yang1，2，DING Sheng-hua1，2*

（1. Longping Branch Graduate School， Hunan University， Changsha 410125， PRC; 2. Institute of Agricultural Products Processing，

Hunan Academy of Agricultural Sciences， Changsha" 410125， PRC）

Abstract： In order to optimize the extraction process of anthocyanins from bayberry residue， response surface methodology was used to explore the effect of microwave-assisted extraction on the extraction rate of anthocyanins on the basis of single-factor investigation. Results indicated that the regression model has a high degree of fit （R2=0.9692）， and the lack of fit is not significant （P=0.1336）. Based on effects of experimental factors on extraction rate of anthocyanins from high to low， it was ethanol concentration， proportion solvent： solid， microwave power and extraction time. The optimal extraction conditions for anthocyanins from bayberry residue was ethanol concentration of 80%， proportion solvent∶solid of 25∶1， microwave power of 510 W， and extraction time of 5 min. Under the optimal extraction conditions， the extraction efficiency of anthocyanins from bayberry residue was 9.02 mg/g.

Key words： bayberry residue; anthocyanins; response surface methodology （RSM）; microwave-assisted extraction

花色苷是一種廣泛存在于植物的花、葉和果實中的天然水溶性色素，屬黃酮多酚類化合物[1]，它可使花及水果呈現(xiàn)紅、橙、藍等靚麗顏色。花色苷由糖和花色苷配基（苷元）通過糖苷鍵結合而成[2]，其作為一種天然的食用性色素，是替代合成色素的理想材料。它不但安全性高、資源豐富，且具有一定的營養(yǎng)和藥理作用，在食品、醫(yī)藥、化妝品等領域有著巨大的發(fā)展?jié)摿3-4]。除用作食品著色劑之外，天然花色苷還具

有多種生理活性，如抗癌[5-6]、抗氧化[7-8]、抗炎癥、預

防和控制肥胖和糖尿病[9]、預防心血管疾病等作用[10]。

楊梅（Myrica rubra Sieb et Zucc.）屬楊梅科楊梅屬小喬木植物，是我國的特色水果之一，廣泛種植于我國南方地區(qū)。目前國內楊梅以鮮銷為主，但楊梅由于時令性強，且正值南方地區(qū)高溫高濕的初夏時成熟和采摘，果實不易保存運輸，極容易腐爛變質[11]。

近年來，楊梅深加工產業(yè)發(fā)展逐漸擴大，楊梅在加工成果汁、果酒、果醋等產品時會產生約20%的副產物楊梅果渣，除小部分被用作飼料加工外，大部分被倒掉，不僅會造成環(huán)境污染，也是一種資源浪費[12-13]。

楊梅果渣因富含大量花色苷，可用作提取花色苷的原料來源。目前，提取花色苷的方法主要是傳統(tǒng)的溶劑提取法、發(fā)酵提取法和酶解提取法等。為提高色素得率，越來越多的物理場輔助提取技術被用于花色苷提取，如采用微波、超聲波、高壓水法及脈沖電場等技術破壞細胞壁和細胞膜，提高組織細胞滲透性，縮短提取的時間，其中主要用于楊梅花色苷提取的為超聲波輔助提取法。劉青梅等[12]通過單因素和響應面試驗研究了超聲波輔助提取楊梅渣中花色苷的最佳條件，結果表明：在提取溫度40℃條件下，超聲功率350 W、料液比1∶7 g/mL、提取時間為40 min時得率最高，為20.29 mg/100 g;李濤等[14]研究超聲波輔助提取楊梅中花色苷，得到的最優(yōu)工藝條件為乙醇體積分數(shù)為25%、料液比為1∶14 g/mL、超聲時間為25 min。然而，超聲波提取法仍存在提取時間較長、得率低等問題。近年來，微波輔助提取技術與其他技術相比具有效率高、耗能少、提取時間短、產品純度高、可減少熱敏性物質的分解等優(yōu)點，發(fā)展迅猛。朱璐等[15]通過浸提法、超聲波法和微波法分別提取紫薯花色苷，并比較其抗氧化性強弱，結果顯示：采用微波、超聲波輔助提取有利于紫薯花色苷的抗氧化活性的保持，其中微波輔助提取法的效果最好。另外，張帥等[16]在研究3種不同提取方法提取紅鳳菜花色苷時，確定了微波輔助提取法的最優(yōu)提取工藝參數(shù)為料液比1∶7 g/mL、提取功率700 W、提取時間2 min，花色苷提取物得率6.65%，超聲波輔助提取法的最優(yōu)工藝參數(shù)為料液比1∶11 g/mL、功率270 W、提取溫度80℃、提取時間90 min，花色苷提取物得率8.25%，發(fā)現(xiàn)微波提取法大大縮短了提取時間。試驗采用微波輔助提取法，選取乙醇體積分數(shù)、料液比、功率和時間這4個因素，利用響應面法優(yōu)化楊梅果渣花色苷的最佳提取工藝參數(shù)，旨在變廢為寶、提高楊梅深加工產業(yè)的經濟效率和綜合利用率，為后期花色苷的工業(yè)化提取提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試材料 楊梅果渣由湖南瑞生源生物科技有限公司提供，是指經榨取新鮮楊梅汁后的楊梅果渣;楊梅品種為浙江東魁。

1.1.2 試驗試劑 鹽酸、氯化鉀、氫氧化鉀、無水乙醇、無水醋酸鈉（均為分析純）。

1.1.3 儀器與設備 UV-1800紫外可見分光光度計，購于島津儀器（蘇州）有限公司;SHB-III循環(huán)水式多用真空泵，購于鄭州長城科工貿有限公司;高速離心機TG16K-I，購于長沙東旺實驗儀器有限公司;JE502電子天平，購于上海浦春計量儀器有限公司;MAS-II plus型常壓微波合成/萃取反應工作站，購于上海新儀微波化學科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 楊梅果渣花色苷的微波輔助提取方法 稱取2.00 g預處理過的楊梅渣冷凍干燥粉，置于100 mL三頸圓底燒瓶中，加入一定量的乙醇提取溶劑后，放入微波提取裝置中，在一定條件下微波輔助提取后過濾，再將過濾后的液體轉入50 mL離心管中，以5 400 r/min

離心15 min，取上清液定容至100 mL，測定其吸光度[17]。

1.2.2 花色苷提取的單因素試驗 在一定的提取溫度下，其他條件均保持一致，運用微波輔助提取法分別研究乙醇體積分數(shù)、料液比、微波功率、提取時間對楊梅果渣花色苷提取效果的影響。利用pH示差法，測定各個條件下花色苷的提取量，以此確定單因素試驗的最優(yōu)工藝參數(shù)。

1.2.3 響應面法試驗因素水平設計 為綜合考慮各個因素對楊梅果渣花色苷提取量的影響，在單因素試驗基礎上，根據(jù)Box-behnken的中心組合設計原理，以花色苷的吸光度差值為響應值，對乙醇體積分數(shù)、料液比、微波功率、提取時間4個因素進行優(yōu)化設計，設計了四因素三水平共29組試驗（中心點重復5次，用估計實驗誤差），響應因素水平設計見表1。

1.2.4 楊梅果渣中花色苷含量測定 采用pH示差法[18]：

取氯化鉀緩沖溶液（pH值1.0）、醋酸緩沖液（pH值4.5）各9 mL于50 mL離心管中，再分別加入1 mL待測樣品，充分混勻后平衡1 h，用蒸餾水作空白樣，在520和700 nm處分別測定吸光度（A），并按公式（1）計算稀釋樣品的吸光值。

A=（A520-A700）pH1.0-（A520-A700）pH4.5" " " " " （1）

按公式（2）計算楊梅果渣中花色苷含量。其中，A，吸光度;V，定容體積/L;F，稀釋倍數(shù);M=449.2，車菊色素-3-葡萄糖苷的相對分子質量;ε=26 900，矢車菊色素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù);m，樣品干質量（g）。

（2）

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.0和Design Expert 8.0軟件進行數(shù)據(jù)分析與作圖。

2 結果與分析

2.1 花色苷提取的單因素試驗

2.1.1 乙醇體積分數(shù)對花色苷提取的影響 試驗采用2.00 g楊梅果渣，在溫度40℃、微波功率500 W、料液比為1∶20 g/mL、提取時間為3 min的條件下，運

用微波輔助提取法，考察不同體積分數(shù)的乙醇提取劑對楊梅果渣花色苷的吸光度的影響，結果如圖1所示。

由圖1可知，花色苷提取率隨著乙醇體積分數(shù)的增大而增加，當體積分數(shù)為80%時，花色苷提取率達到最大值，當繼續(xù)增大乙醇體積分數(shù)時，花色苷提取率急劇下降，這是因為花色苷是由苷元和糖基構成，花色苷中的糖苷在高濃度的乙醇溶液中的溶解度下

2.1.2 料液比對花色苷提取的影響 試驗采用2.00 g楊梅果渣，在溫度40℃、微波功率500 W、乙醇體積分數(shù)為80%、提取時間為3 min的條件下，運用微波輔助提取法，考察不同料液比對楊梅果渣花色苷的吸光度的影響，結果如圖2所示。

由圖2可知，隨著料液比的增加，花色苷提取率在1∶20、1∶30 g/mL處均出現(xiàn)明顯波峰?；谔崛⌒Ч畈欢嗟那闆r下，從節(jié)約溶劑的角度出發(fā)，選取1∶20 g/mL為最佳料液比參數(shù)，因為溶劑用量過大會造成成本提高。

2.1.3 微波功率對花色苷提取的影響 試驗采用2.00 g楊梅果渣，在溫度40℃、料液比為1∶20 g/mL、乙醇體積分數(shù)為80%、提取時間為3 min的條件下，運用微波輔助提取法，考察不同微波功率對楊梅果渣花色苷的吸光度的影響，結果如圖3所示。

由圖3可知，微波輔助提取花色苷時，花色苷提取率隨微波功率升高而增大，微波功率500 W時到達最高值，然后隨著微波功率繼續(xù)升高，花色苷提取率下降。當微波功率高于500 W時，可能是由于功率過高而導致加熱溫度過高，使得部分花色苷發(fā)生熱降解，從而使花色苷提取率下降，故微波功率選定為500 W。

2.1.4 提取時間花色苷提取的影響 試驗采用2.00 g楊梅果渣，在溫度40℃、料液比為1∶20 g/mL、乙醇體積分數(shù)為80%、微波功率為500 W的條件下，運用微波輔助提取法，考察不同提取時間對楊梅果渣花色苷的吸光度的影響，結果如圖4所示。

由圖4可知，在提取時間3 min以內時，花色苷的提取率隨提取時間的延長而緩慢升高;提取時間超過3 min后，花色苷的提取率呈緩慢下降趨勢，因為在40℃的條件下，隨著時間延長，會使得部分花色苷發(fā)生熱降解，致使花色苷提取率下降。可見，微波時間對花色苷提取率的影響變化幅度較小，故試驗選定3 min。

從圖1～4綜合來看，在單因素試驗中，宜選取80%乙醇溶液、料液比1∶20 g/mL、微波功率500 W、提取時間3 min為最佳參數(shù)來進行響應面分析試驗。

2.2 花色苷提取的響應面分析

2.2.1 響應面分析優(yōu)化試驗設計及方差分析 根據(jù)Box-behnken的中心組合試驗設計原理，綜合單因素試驗的結果，選取了乙醇體積分數(shù)、料液比、功率、時間進行四因素三水平的響應面分析優(yōu)化試驗，試驗設計與試驗結果見表2。

由表3可知，微波輔助提取花色苷的試驗模型顯著（P<0.000 1），表明此回歸模型的指標高度顯著;并且R2=0.969 2，失擬誤差不顯著（P=0.133 6>0.05），說明此模型與試驗實際擬合度良好，因此可用該回歸方程替代實驗真實點來進行結果分析?；貧w方程的各項顯著性表明：一次項A（P=0.000 8<0.01）、B （P=0.000 1<0.01）極顯著;C（P=0.012 8<0.05）顯著;D（P=0.921 1gt;0.05）不顯著。由此可知，對楊梅果渣花色苷提取率影響排序為：乙醇體積分數(shù)>料液比>微波功率>提取時間;二次項A2（P=0.004 0<0.01）、B2 （P<0.000 1）、C2（P<0.000 1），表明響應值變化相對比較復雜，這3個試驗因子對花色苷的提取率的影響，曲面效應顯著不是簡單的線性關系;由交互項AB值、BC值和AC值（P<0.05），說明料液比、乙醇體積分數(shù)和提取時間的交互作用明顯。

2.2.2 擬合模型的建立 利用Design-Expert軟件對表2的數(shù)據(jù)進行二次回歸擬合，確立了以下回歸預測模型：Y=-0.99-0.070A+0.053B+2.475×10-3C-3.833×

10-3D+8.000×10-4AB-3.500×10-5AC+7.500×10-4AD+

1.750×10-5BC-3.750×10-4BD+7.500×10-5CD+

7.800×10-4A2-5.050×10-4B2-3.300×10-6C2-2.000×10-3D2。

2.2.3 響應面分析 應用Design Expert 8.0軟件對表內數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到了二次回歸方程的響應面及其等高線圖（圖5），通過下列該圖可評價試驗因素的各個響應值交互作用大小，以此確定各個因素的最優(yōu)水平范圍。

從圖5可以看出，料液比和乙醇體積分數(shù)對響應值的影響比較大，微波提取功率次之，而微波時間對花色苷提取量的影響不顯著。綜合而言，在溫度40℃的條件下，用微波輔助提取楊梅果渣花色苷的最優(yōu)條件為：料液比為1∶25 g/mL、乙醇體積分數(shù)為79.08%、微波功率為508.89 W、提取時間為5 min;在此條件下，花色苷提取量預測值為9.02 mg/g。為了便于試驗操作將最優(yōu)條件簡化為：溫度為40℃、料液比為1∶25 g/mL、乙醇體積分數(shù)為80%、微波功率為510 W、提取時間為5 min。

3 結論與討論

在單因素試驗基礎上，采用中心組合設計及響應面分析，建立了料液比、乙醇體積分數(shù)、微波功率及提取時間對楊梅果渣花色苷提取量影響的回歸模型，此回歸模型的R2=0.969 2，失擬誤差不顯著（P=

0.133 6>0.05），說明該模型與試驗實際擬合度良好。通過對回歸模型分析可知，在微波輔助提取楊梅果渣花色苷的過程中，各因素對花色苷提取量的影響程度為：乙醇體積分數(shù)>料液比>微波功率>提取時間;一次項：料液比、乙醇體積分數(shù)、微波功率對花色苷提取量影響顯著，而提取時間影響不顯著;二次項中有3個試驗因子（料液比、乙醇體積分數(shù)、微波功率）對花色苷提取的影響不是簡單線性關系，較為復雜;交互項AB值、BC值、AC值（P<0.05），這說明料液比、乙醇體積分數(shù)和微波功率的交互作用明顯。

應用響應面分析法優(yōu)化提取工藝條件，實驗驗證結果顯示：溫度為40℃、乙醇體積分數(shù)為80%、料液比為1∶25 g/mL、微波功率為510 W、提取時間為5 min，在此條件下楊梅果渣花色苷提取量為9.02 mg/g。

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（責任編輯：夏亞男）