?？墒承越M織中加米霉素殘留量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法的研究

王艷艷,王紅霄,鄧 菲

（華北制藥集團(tuán)動物保健品有限責(zé)任公司,河北 石家莊 050041）

加米霉素（Gamithromycin）,是一種新型的半合成大環(huán)內(nèi)酯類動物專用抗生素[1],通過與敏感菌核糖體的50S亞基不可逆的結(jié)合,使肽酰tRNA解離進(jìn)而阻斷肽鏈的合成進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的合成,最終達(dá)到抑菌和殺菌的作用。該藥由法國梅里亞有限公司研制,其商品名為Zactran（規(guī)格:150 mg/mL）,2007年9月經(jīng)歐盟批準(zhǔn)用于靶動物牛[1],2016年2月經(jīng)歐盟批準(zhǔn)用于靶動物豬[2]。在國外已被用于預(yù)防和治療非泌乳牛和豬的呼吸系統(tǒng)疾病[1-2],并取得了良好的效果。作為第二代大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的代表藥物之一,其具有抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、動物專用、單次給藥、吸收迅速、生物利用度高、低殘留、安全高效等優(yōu)點(diǎn),在畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)中具有非常廣闊的應(yīng)用前景。

目前,動物源性食品中加米霉素殘留量的檢測方法有高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等。高效液相色譜法因其重復(fù)性較好、成本低、定量準(zhǔn)確以及受樣品基質(zhì)影響小等優(yōu)點(diǎn),在一段時間內(nèi)被用于加米霉素的定量檢測[3]。但由于加米霉素紫外吸收弱且吸收波長（215 nm）與流動相中的甲醇（190 nm）、乙腈（205 nm）相近,從而限制了高效液相色譜法的應(yīng)用。液相色譜-質(zhì)譜法（LCMS）和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）為加米霉素的檢測提供了更加靈敏、可靠、快捷的手段[4]。本文建立了其在?？墒承越M織中殘留量的UPLCMS/MS方法。

1 試劑與材料

1.1 試劑 加米霉素（Trc公司;純度為95%）;加米霉素-d5（內(nèi)標(biāo)）（Trc公司;純度為95%）;超純水（Milli-Q超純水儀制取）;乙腈、甲醇均為色譜純（Merck公司）;甲酸、正己烷、磷酸二氫鉀、氨水均為國產(chǎn)分析純;Oasis HLB固相萃取柱（Waters公司;60 mg）; 濾膜（Pall公司,0.2 μm）;硅藻土（Sigma公司,CeliteR545）。

1.2 試劑的配制 0.1mol/L磷酸二氫鉀緩沖液:稱取磷酸二氫鉀13.60 g,溶于1 000 mL水中。

5%氨化乙腈-甲醇（7∶3,v/v）:取氨水5 mL,用乙腈 -甲醇（7∶3,v/v）稀釋100 mL。

加米霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1 mg/mL）:準(zhǔn)確稱取加米霉素標(biāo)準(zhǔn)品適量,于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,配成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。 -20℃貯藏,有效期6個月。

加米霉素-d5內(nèi)標(biāo)儲備液（100 μg/mL）:準(zhǔn)確稱取加米霉素-d5標(biāo)準(zhǔn)品適量,于5 mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,配成濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。 -20℃貯藏,有效期6個月。

加米霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液（10 μg/mL）:取 0.5 mL加米霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液于50 mL容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度。 -20℃貯藏,有效期6個月。

加米霉素 -d5內(nèi)標(biāo)工作液（1 μg/mL）:取0.1 mL加米霉素-d5內(nèi)標(biāo)儲備液于10 mL容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度。-20℃貯藏,有效期6個月。

2 儀器和設(shè)備

高效液相色譜儀-串聯(lián)質(zhì)譜儀（Agilent Technologies 6430）;高速冷凍離心機(jī)（Sigma公司）;氮吹儀（美國Organomation公司）;旋渦混合器（IKA公司）。

3 測定方法[4-10]

3.1 樣品提取凈化 取1 g動物組織,加入適量的標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液,渦動15 s,靜置15 min,加入10 mL 0.1 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液渦動1 min,9 000 r/min離心10 min,收集上清,殘渣用10 mL磷酸二氫鉀緩沖液重復(fù)提取一次;合并上清液,備用。

采用HLB固相萃取柱進(jìn)行凈化。預(yù)先在HLB小柱上方加入0.2 g硅藻土,依次用3 mL甲醇、3 mL水進(jìn)行活化,取備用液10 mL上柱,并確保溶液緩慢流過HLB柱（必要時可采用真空泵）。然后用3 mL 5%氨水、3 mL甲醇∶水（70∶30,v/v）進(jìn)行洗滌。 用3 mL乙腈∶甲醇（70∶30,v/v,含5%氨水）溶液洗脫。 洗脫液于40℃水浴氮?dú)庀麓蹈?。? mL甲醇∶水（50∶50,v/v）溶液復(fù)溶,渦動1 min;加入3 mL正己烷渦動1 min,10 000 r/min離心5 min,棄正己烷,過0.2 μm濾膜,供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定 在空白的牛組織基質(zhì)匹配液中,添加不同量的加米霉素,繪制加米霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 配制成加米霉素濃度為 5、10、20、100、250、500 μg/L,而加米霉素 -d5 濃度為 100 μg/L的系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液,供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定。以測得的加米霉素及內(nèi)標(biāo)的定量離子質(zhì)量色譜峰面積之比為縱坐標(biāo),對應(yīng)的加米霉素濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

3.3 空白組織添加樣品的制備 在1 g空白的牛組織中添加不同量的加米霉素及相同量的加米霉素-d5。工作溶液制備空白添加樣品,對應(yīng)每個組織中的加米霉素的4個濃度。每種組織每個濃度3個批次,每個批次6個平行。這些樣品用于檢查分析方法的靈敏度、分析物的保留時間及評價相對回收率和變異系數(shù)。見表1

表1 牛空白組織中加米霉素添加樣品的制備

3.4 色譜條件 色譜柱:Luna C18,2.1×50 mm,5 μm;流動相:A相為0.1%甲酸水溶液;B相為0.1%甲酸乙腈溶液;流速:0.25 mL/min;柱溫:30 ℃ ;進(jìn)樣量:5 μL。

梯度洗脫:梯度洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫條件

3.5 質(zhì)譜條件 離子源:電噴霧離子源;掃描方式:正離子掃描;檢測方式:多反應(yīng)監(jiān)測;電離電壓:3.0 kV;霧化溫度:350℃;霧化氣流速:540 L/h。

測試藥物定性、定量離子對及對應(yīng)的裂解電壓、碰撞能量見表3。

表3 加米霉素的定性、定量離子及裂解電壓、碰撞能量

3.6 定量測定 取試樣溶液和相應(yīng)的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液,按內(nèi)標(biāo)法定量,標(biāo)準(zhǔn)工作液及試樣溶液中的加米霉素的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測的線性范圍內(nèi)。方法學(xué)驗證時的添加回收樣品,采用單點(diǎn)校正的方式定量。

3.7 計算 標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合采用最小線性二乘法,準(zhǔn)確度和精密度的計算采用單點(diǎn)校正法。

4 結(jié)果

4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 各組織標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程和相關(guān)系數(shù),見表4。

表4 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性驗證結(jié)果

4.2 靈敏度 在空白組織中添加不同濃度的加米霉素,測定信噪比（S/N）≥3時為檢測限,S/N≥10時為定量限。本方法對于牛肌肉、肝臟、腎臟和脂肪添加濃度為1μg/kg時其信噪比（S/N）分別為:9.1、8.3、14.1、22.3;本方法對于牛肌肉、肝臟、腎臟和脂肪添加濃度為2 μg/kg時其信噪比（S/N）分別 為:28.4、31.5、36.9、38.2,平 均 回 收 率93.56%～103.89%,批內(nèi)變異系數(shù)1.82%～8.68%,批間變異系數(shù)2.79% ～6.70%,故定量限均可設(shè)定為 2 μg/kg。

4.3 準(zhǔn)確度和精密度 取表1制備的空白添加樣品,按上述方法處理、測定后,計算組織樣品中加米霉素的回收率和變異系數(shù)。組織樣品的回收率結(jié)果見表5、表6,變異系數(shù)結(jié)果見表7、表8。

表5 牛肌肉和豬肝臟中加米霉素的回收率/%

表6 牛腎臟和牛脂肪中加米霉素的回收率/%

表7 牛肌肉和牛肝臟中加米霉素的變異系數(shù)/%

表8 牛腎臟和牛脂肪中加米霉素的變異系數(shù)/%

5 結(jié)論

本試驗建立了一種快速、可靠的“牛組織中加米霉素殘留量測定-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法”,在牛肌肉、肝臟、腎臟、脂肪中的加米霉素的檢測限均可設(shè)定為1 μg/kg,定量限均可設(shè)定為2 μg/kg,基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為 5 μg/L～500 μg/L,相關(guān)系數(shù) ＞0.99;牛肌肉和腎臟組織在2、50、100、200 μg/kg 四個添加濃度的平均回收率為93.56% ～103.31%,批內(nèi)變異系數(shù)≤8.67%,批間變異系數(shù)≤6.70%;牛肝臟組織在2、100、200、400 μg/kg 四個添加濃度的平均回收率為94.37% ～102.52%,批內(nèi)變異系數(shù)≤5.70%,批間變異系數(shù)≤4.61%;牛脂肪組織在2、10、20、40 μg/kg四個添加濃度的平均回收率為100.95% ～105.58%,批內(nèi)變異系數(shù)≤5.89%,批間變異系數(shù)≤4.52%;該方法樣品處理方法簡便、靈敏度高,適用于牛可食性組織中加米霉素的殘留監(jiān)測。