白苦敗痢散對靶動物豬的安全性試驗(yàn)

張鶴平,劉建釵,劉彥威,許劍琴,閆金坤,楊俊琦,劉利強(qiáng),李廣東,孟憲華,馬云飛,王九峰

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,北京 海淀 100193;2.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院,河北 邯鄲 056021;3.邯鄲市動物醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 邯鄲 056021;4.河北省畜牧站,河北 石家莊 050035）

白苦敗痢散由白頭翁、苦參、敗醬草、厚樸、葶藶子組成,是治療豬腹瀉的中藥復(fù)方制劑。該藥以白頭翁湯的組方[1-2]和治療原則結(jié)合臨床癥狀、生產(chǎn)性能等為評價指標(biāo),通過前期臨床試驗(yàn)進(jìn)行中藥復(fù)方篩選并確定中藥組方,前期經(jīng)過小鼠急性毒性試驗(yàn)和長期毒性試驗(yàn)[3-4],顯示該制劑安全。通過小鼠的抗炎、防治腹瀉和體外抑菌、殺菌藥效學(xué)試驗(yàn),表明白苦敗痢散具有相關(guān)的藥效作用。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究白苦敗痢散對臨床發(fā)病豬的治療效果。為了評價白苦敗痢散臨床應(yīng)用于靶動物豬的安全性,明確安全劑量范圍,試驗(yàn)依據(jù)農(nóng)業(yè)部《獸藥研究技術(shù)指導(dǎo)原則匯編》有關(guān)規(guī)定,通過不同劑量灌服給藥的方式開展白苦敗痢散對豬的安全性試驗(yàn),為其臨床用藥提供試驗(yàn)依據(jù)[5]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)藥品 白苦敗痢散,中試批號:20160301;規(guī)格0.5 g/g,每1 g散劑中含0.5 g生藥;中試生產(chǎn)廠家:北京中農(nóng)勁騰生物技術(shù)股份有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)動物 4日齡健康三元雜交哺乳仔豬32頭。試驗(yàn)在邯鄲市某豬場進(jìn)行,試驗(yàn)動物在哺乳豬舍內(nèi)使用產(chǎn)床飼養(yǎng)。按豬場常規(guī)程序進(jìn)行消毒、免疫。

1.2 試驗(yàn)動物分組及給藥（處理） 根據(jù)《獸用中藥、天然藥物臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》,選擇4窩窩次相近,窩仔數(shù)在8頭左右的4日齡健康三元雜交哺乳仔豬,每窩仔豬數(shù)均調(diào)為8頭。4窩仔豬隨機(jī)分為4組,以推薦的臨床用藥劑量（2 g/kg·bw）設(shè)置白苦敗痢散1、3、5倍劑量組,白苦敗痢散以生理鹽水稀釋成10 mL,每天上午9:00灌服給藥;對照組灌服生理鹽水10 mL,每天1次,連續(xù)7 d。分組及處理見表1。

表1 白苦敗痢散對靶動物的安全性試驗(yàn)分組設(shè)計(jì)

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 臨床表現(xiàn) 每天上午10:00、下午2:00觀察記錄試驗(yàn)動物精神狀態(tài)、哺乳、行為、糞便形態(tài)、死亡情況及中毒情況等。對死亡試驗(yàn)動物及時剖檢并記錄剖檢結(jié)果。

1.3.2 生產(chǎn)性能 試驗(yàn)前和試驗(yàn)后（于試驗(yàn)第1天、第8天）對仔豬逐頭進(jìn)行稱重,根據(jù)給藥前后豬只體重,計(jì)算每組豬的平均增重。

1.3.3 血液生理學(xué)、生化學(xué)檢測 給藥第8天,將每組8頭豬通過前腔靜脈采血,分為EDTA抗凝處理和非抗凝處理,非抗凝處理血液靜置1.5 h后,10 000 r/min（4℃）離心5 min,取血清于-20℃保存?？鼓幚淼难河糜谘荷碇笜?biāo)檢測,非抗凝處理的血液分離得到血清用于血清生化指標(biāo)檢測。在邯鄲市第一醫(yī)院血液化驗(yàn)室進(jìn)行血液生理和生化指標(biāo)檢測。對每頭豬采血進(jìn)行血液生理指標(biāo)（白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白、紅細(xì)胞壓積等）和血液生化指標(biāo)（谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、尿素氮、肌酐、總蛋白等）檢測。隨即進(jìn)行剖檢病變觀察和臟器指數(shù)測定。

1.3.4 臟器指數(shù)測定 給藥第8天,每組隨機(jī)選取3頭試驗(yàn)仔豬分別稱重并剖檢,對心、肝、脾、肺、腎進(jìn)行稱重,計(jì)算臟器系數(shù)。觀察臟器病理變化,并取心、肝、脾、肺、腎組織樣品置于4%多聚甲醛中固定,進(jìn)行常規(guī)石蠟切片做組織病理學(xué)觀察。

根據(jù)下列公式計(jì)算各器官與體重的比值,即臟器系數(shù)。

臟器系數(shù) =臟器重量（g）/體重（g） ×1 000‰

1.3.5 組織病理學(xué)觀察 試驗(yàn)結(jié)束時,剖檢,肉眼觀察、記錄上述各組剖檢試驗(yàn)仔豬各臟器、組織是否有病理變化,包括心臟、肺臟、肝臟、腎臟、脾臟、腸道等。將4%多聚甲醛固定的肝臟、脾臟、肺臟、腎臟進(jìn)行常規(guī)石蠟切片,H.E.染色,觀察病理組織學(xué)變化。

1.4 結(jié)果分析 統(tǒng)計(jì)分析將采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行計(jì)算。用單因素方差分析和多重比較對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和差異顯著性比較,試驗(yàn)結(jié)果以平均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差（±S）表示,P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 臨床觀察 試驗(yàn)期內(nèi),對照組、1倍劑量組、3倍劑量組、5倍劑量組所有試驗(yàn)動物健康狀況良好,精神狀況、哺乳、行為、糞便情況均正常。整個試驗(yàn)期間試驗(yàn)動物均無死亡。

2.2 各組試驗(yàn)豬體重、平均增重的變化 表2表明,試驗(yàn)前各試驗(yàn)組豬體重?zé)o顯著差異,試驗(yàn)結(jié)束時,各試驗(yàn)組平均增重?zé)o顯著差異（P＞0.05）。

表2 白苦敗痢散對豬體重的影響 （n=8）

2.3 血液生理指標(biāo)的變化 分別檢測各試驗(yàn)組仔豬血液中紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（RBC）、白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）、血紅蛋白測定（HGB）、紅細(xì)胞壓積（HCT）、平均紅細(xì)胞體積（MVC）、血小板計(jì)數(shù)（PLT）、紅細(xì)胞平均血紅蛋白含量（MCH）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度（MCHC）。表3表明,各試驗(yàn)組間仔豬的各項(xiàng)指標(biāo)均無顯著差異（P＞0.05）。

2.4 血清生化指標(biāo)的變化 分別檢測各試驗(yàn)組仔豬血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總蛋白（T/P）、尿素氮（BUN）、肌酐（CRE）含量。 表4 表明,各試驗(yàn)組間仔豬的各項(xiàng)指標(biāo)均無顯著差異（P＞0.05）。表4表明白苦敗痢散對靶動物豬肝臟、腎臟功能無不良影響。

表3 白苦敗痢散對豬血液生理指標(biāo)的影響 （n=8）

表4 白苦敗痢散對豬血清生化指標(biāo)的影響 （n=8）

2.5 病理學(xué)變化和對臟器指數(shù)的影響 剖檢病理變化觀察結(jié)果顯示,各組試驗(yàn)仔豬主要臟器的形態(tài)、大小、顏色等均未見明顯異常變化。未見出血點(diǎn)、水腫、增生等病理變化。

表5表明,與對照組仔豬的心、肺、脾、肝、腎臟器指數(shù)相比,白苦敗痢散1、3、5倍劑量組均未見顯著異常（P＞0.05）。病理剖檢觀察,各組試驗(yàn)仔豬的主要臟器未見出血點(diǎn)、水腫、增生等病理變化。對心、肺、脾、肝、腎、十二指腸等重要器官進(jìn)行組織切片,H.E.染色結(jié)果相比顯示,與對照組相比,白苦敗痢散1、3、5倍劑量組仔豬各器官的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)完整,無明顯病理變化。

表5 白苦敗痢散對豬臟器指數(shù)的影響 （n=3）

2.6 組織學(xué)觀察 給藥結(jié)束后,分別對空白對照組豬、1倍劑量組豬、3倍劑量組豬、5倍劑量組豬中隨機(jī)選取3頭豬,采集心、肝、脾、腎、肺等各部位組織,肉眼觀察無病理變化。將各組織切片進(jìn)行H.E.染色,顯微鏡鏡檢觀察也無病理變化。中插彩版圖1為白苦敗痢散對照組、1倍劑量組豬、3倍劑量組豬、5倍劑量組的組織學(xué)切片。結(jié)果顯示,所有豬的心臟、肝、脾、肺、腎等均未發(fā)現(xiàn)明顯的組織病理學(xué)變化。（1）心臟中的心肌結(jié)構(gòu)正常,心外膜、心內(nèi)膜結(jié)構(gòu)正常;（2）肝臟中肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常,中央靜脈及周圍呈放射狀排列的肝索清晰、排列整齊;（3）脾臟紅髓、白髓分界明顯,脾小體之間紅髓清晰可見;（4）腎中腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)完整,近曲小管、遠(yuǎn)曲小管結(jié)構(gòu)正常;（5）肺組織結(jié)構(gòu)正常,肺泡腔、肺泡囊清晰,肺泡隔結(jié)構(gòu)正常。

3 結(jié)論與討論

豬腹瀉由多種致病因素造成,主要包括病原微生物（細(xì)菌、病毒、寄生蟲等）、營養(yǎng)性因素、氣候性因素及其他因素。各生長階段豬都可發(fā)病,以仔豬腹瀉最為多發(fā)[8-10]。腹瀉會導(dǎo)致豬存活率降低、生長發(fā)育緩慢甚至停滯、飼料報酬降低,嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的生產(chǎn)效益。獸醫(yī)臨床多使用抗菌素類藥物治療,導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性升高,抗菌藥物療效降低,藥物殘留對食品安全和公共衛(wèi)生也產(chǎn)生威脅[11]。應(yīng)用高效、低毒、低殘留、低耐藥性的藥物用來防治豬腹瀉,是需要迫切解決的問題。許多中藥對豬腹瀉有治療作用,且具有毒性低,不易產(chǎn)生耐藥性,無藥物殘留、治療效果顯著、提高機(jī)體免疫力、價格低廉等優(yōu)點(diǎn)[12]。

白頭翁苦寒,清熱解毒,涼血止痢,為君藥?？鄥⒖嗪?敗醬草辛苦寒,清熱燥濕,解毒消癰,共為臣藥。厚樸苦溫,行氣燥濕,降逆平喘,行胃腸之滯氣并降肺氣平喘;葶藶子辛苦寒,瀉肺平喘,行水消腫,共為佐使藥。全方共奏清熱解毒,涼血止痢,降氣平喘,調(diào)整胃腸功能,提高機(jī)體免疫力之功效。

靶動物安全性試驗(yàn)是為了了解不同劑量受試獸藥作用于靶動物后,從有效作用到毒性作用,或到致死作用的持續(xù)動態(tài)變化的過程。進(jìn)行靶動物安全性試驗(yàn)的目的是考察受試獸藥在靶動物使用時的安全性及安全劑量范圍,為進(jìn)一步制定臨床試驗(yàn)給藥方案提供依據(jù)。觀察指標(biāo)包括臨床體征觀察、血液生理生化指標(biāo)、二便（糞便、尿）等,有條件或必要時可進(jìn)行剖檢和組織病理學(xué)檢查[7,13-14]。

本研究在前期經(jīng)過小鼠急性毒性試驗(yàn)和長期毒性試驗(yàn),確定白苦敗痢散對小鼠的安全性的基礎(chǔ)上,主要通過臨床觀察、血液生理生化指標(biāo)檢測、臟器指數(shù)觀測、組織病理學(xué)變化研究白苦敗痢散對豬的安全性。以推薦的白苦敗痢散臨床用藥劑量為基礎(chǔ)設(shè)置了1倍劑量組、3倍劑量組、5倍推薦劑量組共3個劑量組。研究表明,整個試驗(yàn)期間所有試驗(yàn)動物的精神狀態(tài)、哺乳、飲水、糞便等均未出現(xiàn)異常,血液學(xué)、血液生化指標(biāo)未見顯著差異。剖檢未發(fā)現(xiàn)明顯的病理學(xué)變化。與對照組相比,1倍推薦劑量組、3倍推薦劑量組、5倍推薦劑量組的平均增重?zé)o顯著性差異。

結(jié)果表明,臨床推薦劑量的1倍、3倍、5倍的白苦敗痢散對靶動物豬是安全的。