腸源性內(nèi)毒素血癥對(duì)慢性乙型肝炎患者細(xì)胞免疫功能影響

莊潔偉，郭輝，郭文麗，汪小娟

（廣東省深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，廣州 深圳 518100）

慢性乙型肝炎是指乙肝病毒檢測(cè)為陽(yáng)性，發(fā)病日期不確定或病程在半年以上且臨床有慢性肝炎表現(xiàn)者，以肝區(qū)疼痛、腹脹及惡心等為主要臨床表現(xiàn)，隨著病情加重，患者可出現(xiàn)肝功能異常、脾大及肝病面容等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1-2]。我國(guó)是世界上病毒性肝炎的高發(fā)地區(qū)，據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前乙肝病毒攜帶者高達(dá)1.3億，給社會(huì)經(jīng)濟(jì)造成沉重的負(fù)擔(dān)，已經(jīng)成為一個(gè)急需解決的重要問(wèn)題[3]。目前，臨床上關(guān)于慢性乙型肝炎的治療尚無(wú)有效的治療方法，核苷類似物和干擾素是臨床上廣泛使用的藥物，但效果并不理想，副作用較大[4-5]。為找出肝病的有效治療手段，需要進(jìn)一步探索肝炎的發(fā)病機(jī)制。近年來(lái)，內(nèi)毒素及細(xì)胞因子形成的免疫網(wǎng)絡(luò)在乙型肝炎發(fā)病中的作用日益受到重視，本研究探討腸源性內(nèi)毒素血癥對(duì)慢性乙型肝炎患者細(xì)胞免疫功能影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院2016年8月‐2017年12月收治的慢性乙型肝炎患者90例作為觀察組，選取同期在本院進(jìn)行正常體檢的健康者40例作為對(duì)照組。兩組均自愿簽署知情同意書，兩組一般資料方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），具有可比性。見(jiàn)表1。

表1 兩組一般資料比較 （±s）

表1 兩組一般資料比較 （±s）

組別 例數(shù) 性別/例 平均年齡/歲 平均體重/kg男 女對(duì)照組 40 23 17 40.33±8.19 68.96±18.63觀察組 90 56 34 40.27±8.24 70.58±19.52 χ2/t值 0.259 0.038 0.443 P值 0611 0.969 0.659

1.2 方法

患者入院后，采集清晨空腹靜脈血5 ml，并應(yīng)用無(wú)熱源試管收集，2 h內(nèi)分離血清，置于-70℃凍存待測(cè)。①ET的檢測(cè)：選用上海伊華科技公司的試劑盒，采用顯色基質(zhì)法鱟試驗(yàn)去熱源處理所有器材，在試管中分別加入0.05 ml鱟試劑和0.05 ml樣品，搖勻后置入37℃水溶25 min，再將0.05 ml鱟試劑水溶于37℃水中3 min，取出后加入萘乙二胺、氨基磺酸銨以及亞硝酸溶液各0.05 ml，搖晃均勻后于545比色讀數(shù)，按照公式A=As-（Ab-Abb），求得吸光度A值，對(duì)應(yīng)內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線求內(nèi)毒素含量。②T淋巴細(xì)胞的兩個(gè)亞群CD4+和CD8+的檢測(cè)：采用聚蔗糖-泛影葡胺分離液分離外周血淋巴細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分離時(shí)，在分層液上疊加肝素抗凝全血，使兩者形成一個(gè)清晰的界面，水平離心后形成不同層次細(xì)胞區(qū)帶和液體，從而將外周血淋巴細(xì)胞分離出來(lái)。層液的密度遠(yuǎn)小于紅細(xì)胞和粒細(xì)胞，沉積于分層液底部的外周血淋巴細(xì)胞密度在1.076～1.090，與分層液密度相比略低，因而主要位于分層液和血漿層的界面中，呈白膜狀，然后將單個(gè)核細(xì)胞吸出，苔盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)。采用美國(guó)BD公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+和CD8+的含量，首先將外周血淋巴細(xì)胞調(diào)整至1.0×106/ml，取100 μl細(xì)胞懸浮液，加入美國(guó)BD公司生產(chǎn)的100 μl PE或FITC標(biāo)記的單克隆抗體，放置在避光的地方染色0.5 h，采用鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院消化研究所提供的試劑PBS 3%多聚甲醛淋巴固體液洗滌兩次，將未結(jié)合的抗體去除，檢測(cè)CD4+和CD8+的含量。③TNF-α、IL-2的檢測(cè)：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法進(jìn)行檢測(cè)，試劑盒由上海瓦蘭生物科技有限公司提供。

1.3 觀察指標(biāo)

比較兩組血漿內(nèi)毒素（endotoxin, ET）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白細(xì)胞介素（interleukin-2, IL-2）以及T淋巴細(xì)胞的兩個(gè)亞群CD4+和CD8+數(shù)目。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示兩組ET、TNF-α、IL-2以及T淋巴細(xì)胞的兩個(gè)亞群CD4+和CD8+數(shù)目，采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組ET、TNF-α、IL-2水平比較

和對(duì)照組相比，觀察組ET和TNF-α水平明顯更高，而IL-2水平明顯更低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表 2。

表2 兩組ET、TNF-α、IL-2水平比較 （±s）

表2 兩組ET、TNF-α、IL-2水平比較 （±s）

組別 例數(shù) ET/(pg/ml) TNF-α/(ng/ml) IL-2/(ng/ml)對(duì)照組 40 0.28±0.20 20.76±5.68 62.60±14.87觀察組 90 0.39±0.02 56.78±10.19 26.60±14.87 t值 5.185 20.929 12.740 P值 0.000 0.000 0.000

2.2 兩組T淋巴細(xì)胞亞群比較

對(duì)照組CD4+和CD4+/CD8+比值明顯高于觀察組，CD8+明顯更低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 兩組T淋巴細(xì)胞亞群比較 （±s）

表3 兩組T淋巴細(xì)胞亞群比較 （±s）

組別 例數(shù) CD4+/% CD8+/% CD4+/CD8+對(duì)照組 40 42.87±7.56 31.20±5.37 1.39±0.39觀察組 90 34.37±6.36 35.25±5.36 0.94±0.34 t值 6.628 3.974 6.652 P值 0.000 0.000 0.000

3 討論

急性病毒性肝炎患者能夠成功地清除病毒是由于細(xì)胞毒性T細(xì)胞對(duì)病毒編碼抗原的反應(yīng)，但對(duì)于慢性乙型肝炎患者，這一反應(yīng)明顯減弱，致使病毒難以清除，主要受細(xì)胞免疫功能的影響[6-7]。因此，有學(xué)者提出治療乙型病毒性肝炎應(yīng)在進(jìn)行抗病毒治療的同時(shí)，解決細(xì)胞免疫力低下的問(wèn)題[8]。慢性乙型肝炎是臨床上常見(jiàn)病和多發(fā)病，嚴(yán)重危害患者健康，乙型肝炎病毒不能被清除是乙型肝炎進(jìn)展的主要原因之一[9]。因此，采取何種措施抑制乙型肝炎病毒復(fù)制，并有效清除是阻止疾病進(jìn)展的關(guān)鍵。大量研究表明[10]，乙型肝炎病毒感染中病毒并沒(méi)有對(duì)肝造成損傷，宿主因素在疾病的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮著重要的作用，特別是細(xì)胞免疫功能方面。

本研究結(jié)果顯示，對(duì)照組IL-2、CD4+和CD4+/CD8+水 平 高 于 觀 察 組，ET、TNF-α 和CD8+水平明顯低于觀察組，表明慢性乙型肝炎患者的ET水平明顯升高，細(xì)胞免疫功能明顯降低。ET是革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁成分，正常情況下，腸道內(nèi)革蘭氏陰性細(xì)菌不斷釋放ET，但腸黏膜上皮細(xì)胞對(duì)ET具有較強(qiáng)抵抗力，使ET難以通過(guò)腸黏膜屏障入血，即使少量ET進(jìn)入肝臟后經(jīng)肝臟枯否氏細(xì)胞解毒而清除。腸源性內(nèi)毒素血癥的發(fā)病原因主要為以下幾點(diǎn)：①對(duì)于慢性乙型肝炎患者，由于腸內(nèi)黏膜淤血、腸桿菌科細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)，再加上腸道菌群紊亂，增加ET的吸收；②因肝臟受損，進(jìn)一步降低枯否氏細(xì)胞對(duì)ET的清除能力，從而造成ET水平升高；③機(jī)體細(xì)胞免疫功能下降，ET在對(duì)肝臟枯否氏細(xì)胞進(jìn)行激活時(shí)，會(huì)導(dǎo)致大量的氧自由基產(chǎn)生，和其引起的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)對(duì)細(xì)胞免疫功能有很大的影響，此外，內(nèi)毒素可有效減弱淋巴細(xì)胞對(duì)有絲分裂原刺激的反應(yīng)，改變輔助型淋巴細(xì)胞與抑制型淋巴細(xì)胞的比例，降低IL-2含量及自然殺傷細(xì)胞活性，從而降低細(xì)胞免疫功能，同時(shí)ET可刺激單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α等多種細(xì)胞因子，不僅可以對(duì)ET的多種生物學(xué)作用進(jìn)行介導(dǎo)，還可以使肝臟產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。正常情況下，T淋巴細(xì)胞亞群比例保持平衡，可維持正常免疫功能，但出現(xiàn)比例失衡時(shí)，會(huì)導(dǎo)致免疫功能紊亂，產(chǎn)生一系列的病理生理變化。CD4+亞群的降低和CD8+亞群的上升，分別代表免疫應(yīng)答的正反饋?zhàn)饔玫臏p弱以及負(fù)反饋?zhàn)饔玫脑鰪?qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致免疫功能的降低。IL-2是免疫系統(tǒng)中的一類細(xì)胞生長(zhǎng)因子，由Th1細(xì)胞分泌，在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中具有重要作用。IL-2可激活自然殺傷細(xì)胞活性，增加Th細(xì)胞數(shù)量，從而增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。此外，IL-2還可和TNF-α等細(xì)胞因子形成動(dòng)態(tài)免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，以維持正常免疫調(diào)節(jié)功能。因此，IL-2可反映機(jī)體免疫功能，其水平的下降，直接影響肝炎病毒的清除及T細(xì)胞的增殖。由此可見(jiàn)，對(duì)于乙型肝炎患者的治療應(yīng)降低高水平的內(nèi)毒素血癥，提高患者免疫功能，從而有利于修復(fù)肝臟損傷和清除肝炎病毒。

綜上所述，慢性乙型肝炎患者體內(nèi)ET水平明顯升高，細(xì)胞免疫功能低下紊亂。