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    傳染性法氏囊病毒分子鑒定及序列分析

    2018-12-27 09:09詹麗娥陸冰洋劉華棟王彩先唐娟詹海杰丁樹(shù)榮
    中國(guó)動(dòng)物保健 2018年5期
    關(guān)鍵詞:分子鑒定

    詹麗娥 陸冰洋 劉華棟 王彩先 唐娟 詹海杰 丁樹(shù)榮

    摘要:傳染性法氏囊?。↖nfectious bursal disease,IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal diseasevirus,IBDV)引起的雞和火雞的一種急性、高度接觸性傳染病。本實(shí)驗(yàn)從山西省不同地區(qū)疑似法氏囊病雞中分離到法氏囊病毒,經(jīng)雞胚培養(yǎng)繁殖、電鏡觀察、提取RNA、設(shè)計(jì)引物、cDNA的PCR擴(kuò)增、電泳、測(cè)序。通過(guò)序列分析比對(duì),最后鑒定其為傳染性法氏囊病毒株。

    關(guān)鍵詞:法氏囊病毒;分子鑒定;VP2基因

    雞傳染性法氏囊病(IBD)于1957年首次在美國(guó)東海岸特拉華州南部岡博羅城的肉雞群中發(fā)現(xiàn),因此也稱“岡博羅”病,Wint-orfield于1962年從患病的小雞雞胚中分離出病毒,1972年定名為雞傳染性法氏囊病。80年代以后至90年代以來(lái)歐洲國(guó)家出現(xiàn)了致死率很高的超強(qiáng)毒傳染性法氏囊病病毒株(very virulent IBDV,vvIBDV)。vvIBDV的流行特點(diǎn)及病原特性:對(duì)雞具有很強(qiáng)的致病性,雞對(duì)IBD最易感階段為3~6周齡,vvIBDV不僅能感染有較高母源抗體的3周齡以內(nèi)的雛雞,而且也能引起大周齡雞發(fā)病;死亡率高;引起嚴(yán)重的法氏囊損傷是vvIBDV的又一顯著特點(diǎn):病死雞的法氏囊顯著腫大,嚴(yán)重出血,有的外觀呈“紫葡萄”樣。幾十年來(lái),已遍及幾乎所有養(yǎng)雞國(guó)家,給各國(guó)養(yǎng)雞業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失。傳染性法氏囊病超強(qiáng)毒(IBDV)引起雞的免疫抑制,導(dǎo)致新城疫、馬立克氏、禽流感、傳染性支氣管炎和球蟲(chóng)等病免疫失敗。近年來(lái),山西省及全國(guó)一些地方由于超強(qiáng)毒株的流行,導(dǎo)致常用的傳統(tǒng)IBD弱毒疫苗和滅活疫苗不能提供足夠的保護(hù),而造成免疫失敗,也使本病的流行出現(xiàn)了新的特點(diǎn),從而更加重了對(duì)養(yǎng)禽業(yè)的危害。超強(qiáng)毒株能夠沖破高水平母源抗體,破壞常規(guī)疫苗的保護(hù)作用,不僅能造成體液免疫抑制,而且對(duì)細(xì)胞免疫也有一定影響。本實(shí)驗(yàn)從山西省不同地區(qū)采集疑似法氏囊病雞病料,主要采集的法氏囊特征是腫大、表面充血、出血,呈“紫葡萄樣”;切開(kāi)可見(jiàn)黏膜彌漫性出血,并有黏稠的奶酪樣物質(zhì)覆蓋。經(jīng)病料采集處理、病毒純化繁殖、電鏡觀察、提取RNA、設(shè)計(jì)引物、cDNA的PCR擴(kuò)增、電泳、測(cè)序。通過(guò)序列分析比對(duì),最后鑒定其為傳染性法氏囊病毒株。

    1材料

    1.1雞胚及雛雞

    SPF蛋購(gòu)自山東省家禽研究所,由本實(shí)驗(yàn)室孵化室孵化至所需日齡雞胚。試驗(yàn)雞購(gòu)自山西某雞場(chǎng);

    1.2病料采集處理及病毒純化繁殖

    1.2.1病料的采集處理從山西省不同地區(qū)疑似法氏囊病雞中采集法氏囊病料,用PBS緩沖液無(wú)菌研磨,反復(fù)離心3次,取上清液。保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2病毒純化繁殖SPF雞蛋60枚,分三批入孵,每批20枚。用常規(guī)的絨毛尿囊膜接種法,接種法氏囊病毒乳液,盲傳幾次,收獲絨毛尿囊膜和尿囊液備用。

    1.3試劑及診斷液

    主要試劑:DNA marker 2000為TIANGEN公司產(chǎn)品;AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒為美國(guó)AXYGEN公司產(chǎn)品;PlasmidMinikitl(100)為OMEGA BIO-TEK公司產(chǎn)品;堿法質(zhì)粒提取溶液Solution Ⅰ、Solution Ⅱ、Solution Ⅲ參照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南配制;IBDV陽(yáng)性血清和抗原購(gòu)自中國(guó)哈爾濱獸醫(yī)研究所。

    1.4菌株及載體

    大腸桿菌DH5 α由本實(shí)驗(yàn)室保存;PfastBacHTA表達(dá)載體及相關(guān)產(chǎn)品購(gòu)自Invitrogen;PMD18-T載體為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;限制性內(nèi)切酶EcoRI、Xhol購(gòu)自NEB。

    2方法

    2.1病料采集處理及病毒純化繁殖

    2.1.1病料的采集處理從山西省不同地區(qū)疑似法氏囊病雞中采集法氏囊病料。主要選擇法氏囊外觀水腫呈膠凍樣、出血呈紫葡萄狀。將病料反復(fù)凍融三次,充分釋放病毒粒子,增加病毒粒子含量,1:5生理鹽水無(wú)菌研磨,再等體積加入4,000IU/mL青霉素和2,000IU/mL鏈霉素的雙抗,放入-20℃保存,備用。用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)病毒效價(jià),被檢病毒與標(biāo)準(zhǔn)法氏囊陽(yáng)性血清出現(xiàn)明顯的沉淀線。

    2.1.2病毒純化繁殖取60枚SPF雞蛋,分三批入孵,每批20枚。將第一批20枚雞胚放入溫箱中,每日翻蛋2-3次,注意保持濕度。4日后入孵第二批蛋,再4日后入孵第三批蛋。當(dāng)?shù)谝慌u胚10日齡時(shí),法氏囊病毒乳液加等體積雙抗30min;用常規(guī)的絨毛尿囊膜接種法,接種法氏囊病毒乳液;然后用熔化石蠟封口,放入溫箱繼續(xù)孵育,逐日觀察。24h內(nèi)無(wú)死亡的棄掉,48h以后死亡的雞胚放入4℃保存,120h收集死活胚放入4℃。收獲雞胚絨毛尿囊膜和尿囊液,將絨毛尿囊膜加PBS緩沖液無(wú)菌研磨,研磨后4℃放置1h,加等體積氯仿充分混勻至乳懸液,搖床過(guò)夜,反復(fù)凍融3次后,進(jìn)行第二次接毒。同上述過(guò)程進(jìn)行第三次接毒。第三次接毒收獲的絨毛尿囊膜研磨后,用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)病毒效價(jià),被檢病毒與標(biāo)準(zhǔn)法氏囊陽(yáng)性血清出現(xiàn)明顯的沉淀線。

    2.2引物的設(shè)計(jì)與合成

    根據(jù)genbank登錄IBDVVP2基因參考序列和表達(dá)載質(zhì)粒pFastBacHTA表達(dá)閱讀框設(shè)計(jì)VP2基因擴(kuò)增引物:P1:5-CGGAATTCATGACAAACCTGCAAGATCAAACC-3;P2:5-CCCTCGAGCACCGGCACAGCTATCCTCCTTAT-3:兩頭分別引入EcoRI和Xhol酶切位點(diǎn)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

    2.3病毒RNA的提取

    用Trizol法提取RNA,具體步驟為:取250μL病毒液于一普通的1.5mL EP管中,加入750uL Trizol,震蕩混勻,靜置5min。加入150μL氯仿,震蕩混勻,4℃離心,12,000r/min,5min。取上清加入450μL異丙醇,顛倒混勻,4℃離心,12,000r/min,12min。棄液體,加1mL75%DEPC乙醇洗滌,4℃離心,12,000r/min,5min。棄液體,虹吸,干燥沉淀。加9μL DEPC水,50℃水浴10min,開(kāi)始反轉(zhuǎn)錄。

    反轉(zhuǎn)錄步驟為:10μL RNA、1μL隨機(jī)引物和4μL dNTP混勻,65℃水浴8min后迅速冰浴5min。再加入4μL Buffer、1μL反轉(zhuǎn)錄酶和1μL RNaseinhibitor,37℃水浴2-3h。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,P1和P2為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。

    PCR反應(yīng)體系:5×StarBuffer 5μL,dNTP 2μL,4μL模板,P1和P2各0.5μL,Primestar 0.25μL,ddH,O12.75μL。PCR反應(yīng)條件:98℃預(yù)變性10s;98℃變性10s,55℃退火15s,72℃延伸100s,共30個(gè)循環(huán),72℃終延伸10min。凝膠電泳以鑒定分子量大小。將PCR產(chǎn)物按照AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行回收。取4.5μL回收產(chǎn)物加入5μLSollution Ⅰ和0.5μL Venter,混勻,4℃過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coli DH5 α感受態(tài)細(xì)菌,涂布在用LB配制的1.5%的瓊脂平皿上(含氨芐青霉素100mg/L),37℃培養(yǎng)14h。挑單菌落接種入LB(含氨芐青霉素100mg/L),振搖培養(yǎng)12h。按Plasmid Minikit Ⅰ(100)說(shuō)明書提取質(zhì)粒。質(zhì)粒用EcoRI和Xhol雙酶切鑒定,陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為T-VP2。送上海生工測(cè)序。

    2.4分離株VP2序列分析及推導(dǎo)氨基酸序列分析

    測(cè)序結(jié)果表明,分離株VP2基因核苷酸長(zhǎng)度為1389bp,推導(dǎo)氨基酸序列含有347個(gè)氨基酸,采用DNAstar軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析,對(duì)照IBDV經(jīng)典強(qiáng)、弱毒株及超強(qiáng)毒株高變區(qū)氨基酸序列分析分離株VP2分子特征。

    2.5數(shù)據(jù)分析

    分離株VP2高變區(qū)遺傳進(jìn)化樹(shù)分析應(yīng)用生物軟件DNASTAR,對(duì)分離株和其他40株登錄在GenBank中的參考毒株的VP2基因高變區(qū)(435bp)進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析,參考毒株及登錄號(hào)為:JF907703.1。

    3結(jié)果與分析

    3.1病毒純化繁殖結(jié)果

    病料經(jīng)無(wú)菌處理及雞胚繁殖、通過(guò)差速離心和密度梯度超速離心后負(fù)染、電鏡觀察表明:病毒的三維立體結(jié)構(gòu)表明,IBDV病毒顆粒并非球形,呈T=13對(duì)稱,五倍軸延伸直徑為72nm,而三倍軸延伸直徑為66nm(見(jiàn)圖1)。

    3.2VP2基因擴(kuò)增結(jié)果

    VP2基因擴(kuò)增圖譜(見(jiàn)圖2)。

    3.3T-VP2酶切鑒定結(jié)果

    T-VP2酶切鑒定結(jié)果(見(jiàn)圖3)。

    3.4IBDV同源性分析結(jié)果

    測(cè)序結(jié)果表明,VP2基因核苷酸長(zhǎng)度為1356bp,推導(dǎo)編碼452個(gè)氨基酸。采用DNAstar軟件將IBDV株VP2基因與國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的VP2基因核苷酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)。結(jié)果表明,IBDV株VP2核苷酸序列與日本超強(qiáng)毒株OKYM同源性最高為99.2%,與其他兩株超強(qiáng)毒株同源性高達(dá)98.9%、97.9%,而與強(qiáng)毒株52/70株和變異株variant E同源性較低分別為96.5%與96.2%,與中等毒力致弱株B87和2512、經(jīng)典弱毒株D78和Cu一1以及疫苗株CEF94同源性在96.0%~96.4%之間,與Ⅱ型毒株同源性最低分別為81.6%、81.8%(見(jiàn)圖4)。

    同時(shí),對(duì)VP2氨基酸序列進(jìn)行同源性分析,結(jié)果表明IBDV VP2氨基酸序列與超強(qiáng)毒株OKYM、HK46同源性最高均為99.6%,與強(qiáng)毒株52/70同源性次之為99.1%,與弱毒株及變異株同源性相對(duì)較低,從氨基酸水平表明IBDV分離株與強(qiáng)毒株關(guān)系密切(見(jiàn)圖5)。

    3.5IBDVVP2高變區(qū)氨基酸序列分析結(jié)果

    IBDV分離株VP2同源性與超強(qiáng)毒株最高,而IBDV病毒毒力相關(guān)分子和致病性分子標(biāo)志主要分布在高變區(qū),因此采用DNAstar軟件對(duì)IBDV VP2高變區(qū)與強(qiáng)毒參考毒株進(jìn)行比對(duì)分析,結(jié)果表明,除222位點(diǎn)外,IBDV VP2高變區(qū)具備與超強(qiáng)毒株高變區(qū)一致的特征性氨基酸,即第249位和第254位氨基酸為O和G,SWSASGS七肽區(qū)不變,第279和第284位氨基酸分別為D和A,第294和第299位分別是特征性氨基酸I和S,盡管該分離株第222位是S而不是典型超強(qiáng)毒株的A,但其余關(guān)鍵位點(diǎn)均與強(qiáng)毒株相符(如圖6)。

    3.6IBDV VP2遺傳進(jìn)化分析

    根據(jù)IBDV VP2高變區(qū)核苷酸序列與參考毒株相應(yīng)序列,采用軟件MEGA 5.1構(gòu)建基因進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行分析。結(jié)果表明,這些毒株共形成2個(gè)大的分支:血清Ⅰ型和血清Ⅱ型,其中血清Ⅰ型毒株又分為超強(qiáng)毒株、強(qiáng)毒株、變異株和弱毒疫苗株4個(gè)小的分支,IBDV與強(qiáng)毒株HK46、OKYM、KSH屬同一進(jìn)化分支,親緣關(guān)系最近,與變異株、強(qiáng)毒株次之,與弱毒疫苗株親緣關(guān)系最遠(yuǎn),說(shuō)明與強(qiáng)毒株具有更密切的親緣關(guān)系(圖7)。

    4討論

    IBD是危害我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)的重要傳染性疾病,在我國(guó)不同地區(qū)都有發(fā)生的報(bào)道,自上世紀(jì)80年代以來(lái),歐洲及我國(guó)相繼出現(xiàn)IBDV強(qiáng)毒株(very virulent IBDV,vvIBDV)的流行,尤其是從21世紀(jì)初變異株和強(qiáng)毒的流行,已嚴(yán)重威脅著包括我國(guó)在內(nèi)的世界養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展。在我國(guó)相繼報(bào)道了HZ株、GZ株、安徽地區(qū)分離株等,但在山西地區(qū)還未見(jiàn)有報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)是首次在山西地區(qū)分離到超強(qiáng)毒株。

    本病通常用疫苗預(yù)防即能取得較好的效果,但近幾年不斷的有養(yǎng)雞場(chǎng)發(fā)生大量的雞感染死亡。大多是由于IBDV變異株的抗原性和經(jīng)典疫苗株間有差異,引起免疫抑制?;蚴莢vIBDV的出現(xiàn)不僅能產(chǎn)生免疫抑制,其超強(qiáng)的致病力能導(dǎo)致雞群的高死亡率。本實(shí)驗(yàn)采樣雞場(chǎng)同樣具有較高的死亡率,其特征與國(guó)內(nèi)外雞感染超強(qiáng)毒株后臨床特征一致。

    已有報(bào)道VP2攜帶宿主保護(hù)性抗原決定簇,具有至少2-3個(gè)中和性抗原位點(diǎn),可誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體,并且有血清型特異性。另外VP2的七肽區(qū)決定其致病性和毒力。經(jīng)過(guò)對(duì)多株vvIBDV VP2的研究對(duì)比,分析出其具備3個(gè)重要特征:①在249和254位上的氨基酸分別為O和G,而非K和S,從而保證其抗原性不發(fā)生變異;②七肽區(qū)保持SWSASGS不變,且279和284位分別為D和A,而非N和T,這是IBDV毒株具有致病力的必要條件;③在222、294和299位上具有3個(gè)特征氨基酸,分別為A、I和S,這3個(gè)氨基酸使超強(qiáng)毒的親水性發(fā)生變化,從而使毒力增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)從山西地區(qū)分離到的IBDV分離株完全符合以上VP2基因的重要特征,由此可證明其為vvIBDV。

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