種植體周圍炎齦溝液中MMP—8和MMP—13表達(dá)水平的研究

朱白雪 戴曉瑋 高曉蔚

[摘要]目的：探討基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinase，MMP）-8和基質(zhì)金屬蛋白酶-13（MMP-13）的表達(dá)與種植體周圍炎的關(guān)系，評(píng)價(jià)其可否作為種植體周圍炎診斷的客觀指標(biāo)。方法：使用吸潮紙尖提取40例健康種植體周圍齦溝液樣本，40例種植體周圍炎齦溝液樣本，分別記錄其探診出血指數(shù)（Sulcular bleeding index，SBI），探診深度（Probing depth，PD），并拍攝X線片測(cè)量種植體周圍牙槽骨喪失（Bone loss，BL）情況。使用ProcartaPlexTM多因子分析技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞因子定量檢測(cè)并分析。結(jié)果：種植體周圍炎組SBI和PD值均高于健康種植體組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。種植體周圍炎組GCF中MMP-8含量均高于健康種植體組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；但MMP-13在種植體周圍炎組和健康組齦溝液中的含量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。MMP-8含量與SBI、PD和BL正相關(guān)關(guān)系。結(jié)論：種植體周圍炎齦溝液中MMP-8表達(dá)水平升高，與臨床種植體周圍指標(biāo)有一定的相關(guān)性，可作為種植體周圍炎早期診斷和治療的輔助指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞]種植體周圍炎；MMP-8；MMP-13；齦溝液；生物標(biāo)記物；臨床指標(biāo)

[中圖分類號(hào)]R780.2 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2018）09-0126-04

Expression of MMP-8 and MMP-13 in Gingival Crevicular Fluid of Peri-implantitis

ZHU Bai-xue1，DAI Xiao-wei2，GAO Xiao-wei1

（1.Department of Stomatology，the Fifth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830000，Xinjiang，China；

2.Planting Center，Urumqi Stomatological Hospital，Urumqi 830000，Xinjiang，China）

Abstract： Objective To investigate the relationship between matrix metalloproteinase-8 （MMP-8） and matrix metalloproteinase-13 （MMP-13） expression and peri-implantitis， and evaluate whether it can be used as an objective indicator for early diagnosis of peri-implantitis. Methods 40 cases of gingival crevicular fluid around healthy implants and 40 cases of peri-implantitis gingival crevicular fluid samples were extracted with moisture absorbing papertips. The sulcus bleeding index， probing depth and X-ray were recorded.Quantitative detection and analysis of MMP-8 and MMP-13 by ProcartaPlexTM multifactor analysis. Results The values of SBI and PD in the peri-implantitis group were higher than those in the healthy implant group， the differences were statistically significant（P<0.05）. The content of MMP-8 in GCF of peri-implantitis group was higher than that of the healthy implant group（P<0.05）. However， there was no significant difference in the content of MMP-13 in the gingival crevicular fluid between the peri-implantitis group and the healthy implant group（P>0.05）. Existence of positive correlation between MMP-8 and SBI、PD and BL. Conclusion Increased expression of MMP-8 in gingival crevicular fluid has a certain correlation with clinical indicators of implants， and can be used as an auxiliary indicator for early diagnosis and treatment of peri implant inflammation.

Key words： peri-implantitis； MMP-8； MMP-13； gingival crevicular fluid； biomarkers； clinical indicators

種植體周圍炎是種植修復(fù)遠(yuǎn)期失敗的主要原因之一[1-2]。據(jù)報(bào)道其發(fā)病率為18%～35%[3-4]。近十年的分子生物學(xué)及免疫學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，種植體周圍炎患者齦溝液中的細(xì)胞因子含量變化與該病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可作為種植體周圍炎早期診斷和治療的重要指標(biāo)[5]?；|(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）是免疫應(yīng)答過(guò)程中產(chǎn)生的一類重要的蛋白溶解酶，負(fù)責(zé)組織降解和再生蛋白，通過(guò)水解肽鏈裂解蛋白的同時(shí)能夠通過(guò)激活其自身活性從而增強(qiáng)細(xì)胞因子、趨化因子和生長(zhǎng)因子的蛋白質(zhì)水解和炎性反應(yīng)過(guò)程，在結(jié)締組織和骨組織的破壞吸收過(guò)程中起重要作用。與牙周炎，齲病，頜骨囊腫，惡性腫瘤等組織破壞性疾病密切相關(guān)[6-8]。MMP-8是齦溝液中的主要膠原酶，由多核細(xì)胞釋放，然而近年來(lái)一些研究表明非多核細(xì)胞，如軟骨細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，成牙本質(zhì)細(xì)胞等亦可產(chǎn)生MMP-8，與細(xì)胞外基質(zhì)Ⅰ型膠原的降解密切相關(guān)[9]。MMP-13在種植體周圍炎的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用，其含量在一定程度上反映了種植體周圍炎的演變過(guò)程，另外它在刺激破骨細(xì)胞活力方面的特性使其有望能夠在已發(fā)生骨吸收的界面重新形成骨結(jié)合方面有所貢獻(xiàn)[10-11]。本研究主要檢測(cè)MMP-8、MMP-13在健康種植體和炎癥種植體齦溝液中的表達(dá)水平的差異，判斷其與探診深度（Probing depth，PD）、齦溝出血指數(shù)（Sulcular bleeding index，SBI）和牙槽骨喪失（Bone loss，BL）的相關(guān)性，為診斷和治療種植體周圍炎提供依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象：按照納入及排除標(biāo)準(zhǔn)選擇2016年12月-2017年12月就診于烏魯木齊市口腔醫(yī)院的種植修復(fù)患者80例（80顆）。通過(guò)倫理審查后，根據(jù)種植體周圍情況分為種植體周圍炎組（40顆）和健康種植體組（40顆）。

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡20～60歲者；②種植體型號(hào)為瑞士Straumann種植體系統(tǒng)者；③種植義齒行駛功能1年以上者；④種植義齒修復(fù)類型不限。種植體周圍炎組需根據(jù)美國(guó)牙周病學(xué)的指導(dǎo)方針，符合以下標(biāo)準(zhǔn)中1個(gè)以上者可診斷為種植體周圍炎：種植體周圍齦組織或黏膜充血、腫脹、溢膿；種植體周袋>3mm或有骨袋形成；種植體松動(dòng)度≥Ⅰ度；X線檢查有輕～中度水平的骨吸收或伴個(gè)別垂直吸收，骨組織的喪失在種植體的第一個(gè)螺紋以下。健康種植體組：種植體周圍黏膜正常；種植體周圍無(wú)牙槽骨吸收；PD≤3mm，SBI<2。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：①全身系統(tǒng)性疾病者；②接受過(guò)種植體周圍炎治療者；③近3個(gè)月使用過(guò)抗生素及非甾體類藥物者；④過(guò)高咬合者。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床指標(biāo)檢測(cè)：探診深度：用牙周探針沿牙齒長(zhǎng)軸方向輕輕探到袋底或齦溝底，需特別注意探診壓力控制在20～25N，取最深處記錄牙周袋深度。

齦溝出血指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0=牙齦健康探針無(wú)出血；1=探診出血，齦乳頭及邊緣無(wú)水腫及顏色改變；2=探診出血，齦乳頭及邊緣有顏色改變，無(wú)水腫；3=探診出血，齦乳頭及邊緣有顏色改變，輕度水腫；4=探診出血，齦乳頭及邊緣有顏色改變，明顯水腫；5=探診出血，有自發(fā)出血和顏色改變及水腫。

1.2.2 X片檢測(cè)：采用平行投照法拍攝X線片，并與種植體初始片比較，測(cè)量種植體周圍牙槽骨吸收量。

1.2.3 齦溝液（Gingival crevicular fluid，GCF）提?。好蘧砀魸?、干燥牙面，將40#吸潮紙尖（天津加發(fā)醫(yī)療器械公司）插入齦溝底部，30s后取出，若紙尖帶血?jiǎng)t棄去重新采集，將浸濕部分剪入凍存管中，每顆種植體重復(fù)取樣6次，分別位于種植體的頰側(cè)近中、中央、遠(yuǎn)中，舌側(cè)近中、中央、遠(yuǎn)中，每一樣本皆含4根吸潮紙尖，-70oC冷凍保存。

1.2.4 MMP-8和MMP-13含量測(cè)定：取出ProcartaPlex試劑盒（杭州聯(lián)科生物公司）提供的標(biāo)準(zhǔn)品，2 000xg離心10s，加入250μl的1X樣品緩沖液，于其余7個(gè)試管中加入150μl樣品緩沖液，從溶解的標(biāo)準(zhǔn)品中取出50μl放入2試管中，上下吹打10次搖勻，盡量避免氣泡產(chǎn)生，從管2中吸取50μl放入管3中，搖勻，依次轉(zhuǎn)移，完成標(biāo)準(zhǔn)品的梯度稀釋。室溫下解凍標(biāo)本20min，4℃離心（1 000r/min）10min取上清液，在96孔ProcartaPlex多因子檢測(cè)試劑盒的每孔加入50μl微球混合液；靜置3min，倒置去除孔板中的液體；每孔加入150洗液洗滌，重復(fù)3次；30μl的Universal Assay Buffer+20μl的標(biāo)準(zhǔn)品或樣本；孔板封膜，室溫振蕩孵育2h；去除封膜，將96孔板置于磁性分離板上，靜置3min，倒置去除孔板中的液體；每孔加入150洗液洗滌，重復(fù)3次；每孔加入25μl生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體；孔板封膜，室溫振蕩孵育30min；去除封膜，將96孔板置于磁性分離板上，靜置3min，倒置去除孔板中的液體；每孔加入150洗液洗滌，重復(fù)3次；每孔加入50μl Streptavidin-PE；孔板封膜，室溫振蕩孵育30min；去除封膜，將96孔板置于磁性分離板上，靜置3min，倒置去除孔板中的液體；每孔加入150洗液洗滌，重復(fù)3次；每孔加入100μl Reading Buffer；室溫振蕩5min使微球懸浮后上機(jī)檢測(cè)MMP-8和MMP-13含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：應(yīng)用SPSS 22.0軟件統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，MMP-8、MMP-13及PD符合正態(tài)分布采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，MMP-8和MMP-13的含量與種植體臨床指標(biāo)的相關(guān)分析采用相關(guān)性檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般資料比較：本次共80例患者，每組40例（40顆），兩組年齡、性別及種植部位比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；但種植體周圍炎組的PD、SBI及BL均高于健康種植體組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 兩組齦溝液中MMP-8及MMP-13含量比較：種植體周圍炎組齦溝液中的MMP-8含量明顯高于健康種植體組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；種植體周圍炎組齦溝液中MMP-13含量高于健康種植體組，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.149）。見(jiàn)表2，數(shù)據(jù)分布情況見(jiàn)圖1。臨床指標(biāo)PD、SBI和BL與MMP-8表達(dá)均呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但相關(guān)程度密切性較低，見(jiàn)表3。

2.3 MMP-8含量對(duì)種植體周圍炎的診斷能力：種植體周圍炎齦溝液中MMP-8含量診斷種植體周圍炎的靈敏度為0.65，特異度為0.68，比值比為3.86（95%CI：1.53～9.75，P=0.004）。

3 討論

種植體周圍炎是一種由于細(xì)菌聚集和機(jī)體免疫反應(yīng)所引起的種植體周圍軟、硬組織的慢性進(jìn)展性炎癥反應(yīng)。目前臨床常規(guī)應(yīng)用的診斷方法如臨床檢查和X線診斷只能夠診斷疾病發(fā)生后的嚴(yán)重程度，無(wú)法對(duì)疾病的整個(gè)活動(dòng)過(guò)程進(jìn)行預(yù)測(cè)和判斷。齦溝液是通過(guò)溝內(nèi)上皮和結(jié)合上皮從牙齦結(jié)締組織滲入到齦溝內(nèi)的液體，其成分與該部位的炎癥程度密切相關(guān)[12]。學(xué)者們已經(jīng)就齦溝液中生物標(biāo)記物的表達(dá)水平對(duì)牙周和種植體周圍疾病的預(yù)測(cè)和診斷做了大量研究，希望通過(guò)對(duì)種植體齦溝液內(nèi)生物標(biāo)記物的檢測(cè)提升對(duì)疾病早期診斷的能力，能夠在出現(xiàn)不可逆的骨吸收之前采取相應(yīng)的治療措施[13]。

Christoph等提取了504顆種植體及493顆鄰近天然牙的齦溝液，ELISA定量檢測(cè)MMP-8等基質(zhì)金屬蛋白酶的含量，結(jié)果顯示超過(guò)90%的位點(diǎn)可檢測(cè)到MMP-8，且種植體齦溝液中MMP-8與鄰近牙齒MMP-8的含量存在中等程度的相關(guān)性，與臨床指標(biāo)PD、SBI和BL的也存在一定的相關(guān)性，但相關(guān)性均較差，與本研究結(jié)果一致[14-15]。Costajunior等分別提取健康種植體患者和存在早期種植體失敗患者的口腔黏膜，PCR測(cè)定其MMP-8基因型，結(jié)果顯示病例組MMP-8基因T/T型占63.75%，C/T型占25%，而對(duì)照組C/T型占48%，T/T型占38%，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明MMP-8基因型為T/T時(shí)，已經(jīng)形成了骨結(jié)合的種植體發(fā)生失敗的危險(xiǎn)性較大。綜上所述，MMP-8在種植體周圍炎的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到了很重要的作用，可以作為一個(gè)早期預(yù)防和輔助診斷種植體周圍炎的重要依據(jù)之一[16]。許多研究表明，牙周炎患者齦溝液中MMP-13的含量明顯增加，齦溝上皮和牙齦成纖維細(xì)胞中均有發(fā)現(xiàn)，但MMP-13在種植體周圍炎齦溝液中的表達(dá)水平存在一定的爭(zhēng)議，MMP-13在種植體周圍炎中的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究[11，17]。李德超等在對(duì)28顆健康種植體、12顆炎癥種植體和40顆健康天然牙齦溝液中MMP-13的表達(dá)水平檢測(cè)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，健康種植體組與種植體周圍炎組的MMP-13表達(dá)存在明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但健康種植體與健康天然牙之間沒(méi)有區(qū)別，且MMP-13的含量與PD、SBI的相關(guān)系數(shù)均大于0.8。而在本研究中種植體周圍炎組MMP-13的含量高于健康種植體組，但差異并不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[10]。這種研究結(jié)果的差異可能是因?yàn)闃颖玖坎町愒斐傻?。Marco等在種植釘植入6個(gè)月后分別提取了純鈦組和氧化鋯組愈合帽周圍牙齦組織，免疫組化檢測(cè)MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9和MMP-13的表達(dá)水平，結(jié)果顯示只有MMP-8的含量在兩組中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而牙齦的術(shù)后重建與恢復(fù)效果，純鈦組優(yōu)于氧化鋯組，說(shuō)明種植體周圍軟組織的恢復(fù)與重建可能與MMP-8的表達(dá)水平密切相關(guān)[11]。

本研究采用的是以Luminex為平臺(tái)的ProcartaPlex檢測(cè)技術(shù)定量檢測(cè)MMP-8和MMP-13的表達(dá)水平，采用不同熒光強(qiáng)度的熒光染料標(biāo)記微球，根據(jù)與標(biāo)記了抗體的微球在樣本中結(jié)合抗原的質(zhì)量定量檢測(cè)標(biāo)記物，該方法與常規(guī)ELISA檢測(cè)方法相比，對(duì)取樣的要求較低，即使樣本沾染血液，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果不會(huì)存在較大的影響[18-19]。

4 結(jié)論

MMP-8的表達(dá)水平與種植體周圍炎的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，與探針出血、探診深度和牙槽骨吸收水平存在一定的相關(guān)性。可以將MMP-8同其他生物標(biāo)記物一起聯(lián)合診斷作為早期診斷和預(yù)防種植體周圍炎的輔助依據(jù)，提升種植體周圍炎的早期診斷治療的能力，而對(duì)MMP-13的研究有待進(jìn)一步探索。

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[收稿日期]2018-06-01 [修回日期]2018-07-16

編輯/朱婉蓉