mircoRNA—155表達量、CD4+ T細胞水平與幼兒濕疹的相關性分析

付雪梅 劉秀玲 劉懷奇

[摘要]目的：探討外周血中mircoRNA-155表達量、CD4+ T細胞水平與幼兒濕疹的關系。方法：選取2016年1月-2016年12月筆者科室診治的120例濕疹患兒作為病例組，另選取同期60例健康幼兒作為對照組，對比兩組外周血中mircoRNA-155表達量、CD4+ T細胞、嗜酸性粒細胞、血清免疫球蛋白E（IgE）水平，并探討其關系。結果：病例組患兒的嗜酸性粒細胞、血清IgE、Treg、Th2及Th17水平均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；病例組患兒的Th1/Th2水平顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。慢性期、亞急性期、急性期患兒的嗜酸性粒細胞、血清IgE、Treg、Th2及Th17水平呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。慢性期、亞急性期、急性期患兒Th1/Th2呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。濕疹患兒Treg、Th2、Th17水平與嗜酸性粒細胞、IgE水平呈顯著性正相關，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；濕疹患兒Th1/Th2水平與嗜酸性粒細胞、IgE水平呈顯著性負相關，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論：濕疹幼兒外周血中Th1/2細胞失衡與患兒病情變化具有相關性，mircoRNA-155表達變化不明顯。

[關鍵詞]mircoRNA-155；CD4+ T細胞；濕疹；幼兒；免疫球蛋白E

[中圖分類號]R758.23 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2018）09-0122-04

Analysis of Correlation between MircoRNA-155 Expression， CD4+ T Cell Level and Eczema in Children

FU Xue-mei1，LIU Xiu-ling2，LIU Huai-qi3

（1.Department of Dermatology，Zaozhuang Institute of Dermatology and Venereal Disease Prevention and Control，Zaozhuang 277599，Shandong，China；2.Department of Dermatology，Rizhao Skin Hospital，Rizhao 276800，Shandong，China；3.Department of Medicine，Zaozhuang Prison，Zaozhuang 277599，Shandong，China）

Abstract： Objective To investigate the relationship between the expression of mircoRNA-155， CD4+ T cells and childhood eczema in peripheral blood. Methods 120 cases of eczema treated by the author's department from January 2016 to December 2016 were selected as the case group. Another 60 healthy children were selected as the control group. The levels of mircoRNA-155， CD4+ T cells， eosinophils， and serum immunoglobulin E （IgE） levels in the peripheral blood of the two groups were compared， and the relationship was explored. Results The levels of eosinophil、serum IgE、Treg， Th2 and Th17 in the case group were significantly higher than those in the control group， the differences were statistically significant（P<0.05）. The level of Th1/Th2 in case group was significantly lower than that in the control group（P<0.05）. The levels of eosinophils、serum IgE、Treg， Th2 and Th17 in children with chronic， subacute and acute diseases were gradually increasing（P<0.05）. In chronic phase， subacute stage and acute stage， Th1/Th2 tended to decrease gradually. The levels of Treg， Th2 and Th17 in children with eczema were significantly positively correlated with eosinophils and IgE levels（P<0.05）. There was a significant negative correlation between Th1/Th2 level and eosinophils and IgE levels in children with eczema（P<0.05）. Conclusion The imbalance of Th1/2 cells in the peripheral blood of eczema infants was associated with the changes in children's condition， and the expression of mircoRNA-155 was not significantly changed.

Key words： mircoRNA-155； CD4+ T cells； eczema； children； immunoglobulin E（IgE）

兒童濕疹的持續(xù)發(fā)展，可導致患兒皮膚黏膜的持續(xù)性損傷，并增加遠期皮膚交界性惡性病變的發(fā)生。流行病學研究顯示，現(xiàn)階段臨床上兒童濕疹的發(fā)病率可達233～344/10萬人，特別是在合并有家族性遺傳性皮膚黏膜病變的患兒中，其發(fā)病率更高[1-2]。在探討影響兒童濕疹發(fā)病機制的過程中，可以發(fā)現(xiàn)的是細胞生物學相關因子或者免疫因素的改善，可能是促進兒童濕疹病情進展的核心因素。mircoRNA-155是非編碼RNA，其可以誘導免疫性復合物的沉積，增加免疫功能亢進表現(xiàn)，促進免疫損傷的發(fā)生，進而促進皮膚黏膜的持續(xù)性損傷；CD4+ T細胞或者其不同細胞亞群的改變，可以通過加劇局部Th1/Th2免疫平衡的紊亂，促進自然殺傷性T淋巴細胞或者下游免疫因素及細胞炎癥因子的浸潤，加劇真皮層組織的損傷，促進病情進展[3-5]。為了進一步揭示mircoRNA-155表達量、CD4+ T細胞水平與兒童濕疹的相關性，本次研究選取筆者科室診治的120例濕疹患兒作為病例組，探討了不同指標的異常表達及其與患者病情的關系，現(xiàn)報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料：選取筆者科室2016年1月-2016年12月診治的120例濕疹患兒作為病例組，另選取同期60例健康幼兒作為對照組。病例組：男64例，女56例；月齡1～18個月，平均（8.3±5.6）個月；其中具有過敏家族史77例，病程1～9個月，平均（3.9±2.0）個月；其中急性期62例，亞急性期40例，慢性期18例。對照組：男35例，女25例；月齡1～18個月，平均（9.0±5.1）個月。兩組患兒的年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

1.2 納入及排除標準

1.2.1 納入標準：①幼兒濕疹的診斷標準參考諸福棠《實用兒科學》中的診斷標準；②皮損面積<皮膚面積的30%；③月齡≤18個月；④對照組來源于筆者醫(yī)院兒?？频慕】涤變?。

1.2.2 排除標準：①合并先心病、感染性疾?。毦?、病毒、真菌感染）者；②1個月內使用過免疫調節(jié)劑、糖皮質素類藥物、微生態(tài)制劑（雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊、活性乳酸菌等）者。

1.3 觀察指標：采集患者靜脈血2ml，按照10 000r/min的離心速度進行離心分離血清，每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿，加0.2ml氯仿，劇烈搖動30s，室溫3min，12 000×g，4℃離心15min得到RNA。加等體積異丙醇，-20℃，30min，棄上清，加75%乙醇1ml，振蕩，20μl DEPC水，室溫放置5min使其完全溶解。加入逆轉錄酶5μl，室溫下放置20min后植入37℃水浴鍋中孵育30min，在底物中加入上游引物0.5μM、下游引物0.5μM，RT-PCR反應混合液5μl，dNTP稀釋至20μl，反應條件：95℃ 3min、95℃ 15s、90℃ 5s，一共40個循環(huán)，產(chǎn)物擴增長度為134bp。

清晨采集空腹靜脈血，按照10 000r/min的離心速度進行離心分離，加入5ml抗凝劑，加入淋巴細胞分離液，按照密度梯度離心法分離淋巴細胞，ARMI 1640溶液洗滌3次。采用流式細胞儀雙標法進行CD40+淋巴細胞的檢測。相關標記操作于5ml抗凝管中進行，100UL全血與CD4+ FITC抗體室溫反應25min，采用紅細胞裂解液optiLYse C 溶血素溶解紅細胞，PBS液體洗滌3遍，每次5min，生理鹽水重新懸浮細胞，上機檢測。（FACS calibur流式細胞儀購自美國BD公司，流式細胞抗體購自羅氏檢測公司）。

1.4 病情判斷標準：濕疹患兒的病情判斷標準：急性期：幼兒皮膚紅斑、水腫基礎上出現(xiàn)粟粒樣大丘疹、丘皰疹、水皰、糜爛記滲出，病變中心較重且向周圍蔓延，周圍存在散在的丘疹、丘皰疹，境界不清；亞急性期：表現(xiàn)為紅腫、滲出減輕，可見糜爛面結痂、脫屑；慢性期：表現(xiàn)為皮損部位出現(xiàn)粗糙肥厚、苔蘚樣改變、可伴有色素改變、手足部位濕疹可伴有甲改變。

1.5 統(tǒng)計學分析：統(tǒng)計軟件采用SPSS 16.0，采用均數(shù)±標準差（x?±s）進行統(tǒng)計描述，兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析法，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；相關性分析采用Pearson線性相關分析法。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組幼兒的mircoRNA-155表達量、嗜酸性粒細胞及血清IgE水平比較：病例組患兒的嗜酸性粒細胞、血清IgE水平顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；病例組mircoRNA-155表達量與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。

2.2 兩組幼兒的CD4+ T細胞水平比較：病例組患兒的Treg、Th2、Th17水平顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；病例組患兒的Th1/Th2水平顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；但病例組Th1與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表2。

2.3 不同疾病分期濕疹患兒的mircoRNA-155表達量、嗜酸性粒細胞、血清IgE水平比較：慢性期、亞急性期、急性期患兒的嗜酸性粒細胞、血清IgE水平呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；三組間mircoRNA-155表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表3。

2.4 不同疾病分期濕疹患兒的CD4+ T細胞水平比較：慢性期、亞急性期、急性期患兒的Treg、Th2、Th17水平呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；慢性期、亞急性期、急性期患兒Th1/Th2呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表4。

2.5 濕疹患兒的CD4+ T細胞、mircoRNA-155表達水平與嗜酸性粒細胞、IgE水平的關系：濕疹患兒Treg、Th2、Th17水平與嗜酸性粒細胞、IgE水平呈顯著性正相關，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；濕疹患兒Th1/Th2水平與嗜酸性粒細胞、IgE水平呈顯著性負相關，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表5。

3 討論

兒童濕疹的發(fā)生，主要考慮與長期的自身免疫性損傷或者炎癥損傷等有關，特別是在外界環(huán)境因素誘導或者長期的基礎性體液免疫或者細胞免疫功能紊亂的人群中，兒童濕疹的發(fā)生率或者近期不良臨床預后的發(fā)生率等均明顯惡化[6-7]。但一項匯集了178例樣本量的臨床回顧性分析研究顯示，現(xiàn)階段臨床上兒童濕疹的總體治療效果較差[8]，治療后的患兒的臨床病情緩解率或者免疫指標的改善效果等，均難以到達臨床有效的評估標準[9]。而對于兒童濕疹發(fā)病過程中不同免疫機制的研究，可以為后續(xù)臨床I期或者Ⅱ期臨床實驗提供參考，并為揭示疾病的發(fā)病機理提供依據(jù)。

非編碼RNA的異常表達不僅能夠影響到惡性腫瘤的發(fā)生，同時在自身免疫性疾病或者皮膚性疾病的病情進展過程中同樣發(fā)揮了重要的調控作用。mircoRNA-155能夠影響到不同的生物學炎癥因子如IL-6或者IL-10等的激活，炎癥因子的富集或者交錯式的組織浸潤等方面發(fā)揮作用，促進真皮層下的柱狀上皮細胞的凋亡，加劇正常細胞的分解，加劇新生血管的形成及排列紊亂；Treg、Th2、Th17均是臨床上較為常見的CD4+ T細胞，其濃度的異常表達可以在促進自然殺傷性T淋巴細胞的細胞毒性作用，加劇細胞免疫復合物的沉積，促進真皮下血管的通透性的改善，增加了皮疹紅腫癥狀。已有的部分研究揭示了CD4+ T細胞的異常表達，認為高表達的CD4+ T細胞促進了濕疹的發(fā)生，但缺乏對于其在慢性期、亞急性期、急性期等不同病情患者體內的異常表達的研究，此為本次研究的創(chuàng)新性所在。

本次研究并未發(fā)現(xiàn)mircoRNA-155表達量在病例組及正常對照人群中的表達差異，提示mircoRNA-155的表達并不會影響到患兒濕疹的發(fā)生，這與既往的相關文獻結論存在一定的差別，這主要考慮可能與mircoRNA-155的表達不能影響到真皮層組織細胞的氧化應激損傷或者基底膜細胞的完整性的修復等過程中有關。但細胞免疫相關指標存在明顯的高表達，嗜酸性粒細胞、血清IgE的表達濃度明顯高于正常對照人群，提示濕疹患兒體內仍然存在一定的過敏體質，相關過敏原或者過敏因素介導的免疫因子的激活，均可以促進嗜酸性粒細胞、血清IgE的合成或者釋放，加劇體內遲發(fā)性或者急性的過敏應激反應[10-11]。Treg、Th2、Th17是反應患者CD4+ T細胞激活程度的重要指標，本次研究中Treg、Th2、Th17等均呈現(xiàn)出了高表達，從機制上考慮不同的CD4+ T細胞亞群的高表達，可以在影響到下列幾個方面的途徑，進而促進濕疹患者的病情進展[12-13]：①Treg的表達濃度的改變，影響到了調節(jié)性T細胞的濃度，加劇了細胞免疫的抗原提呈效應，促進了T淋巴細胞依賴的細胞毒性作用；②Th2、Th17等的異常表達，能夠促進下游IL-2或者IL-17等炎癥因子的高度富集，促進單核細胞或者巨噬細胞等對于皮下新生血管的形成障礙、新生血管的螺旋障礙或者血管局部走形或者隆起等異常的發(fā)生。Eyerich K等[14]研究了小樣本量的急性濕疹的臨床血清學檢驗指標后發(fā)現(xiàn)，Th2、Th17或者其分泌的細胞因子等的表達濃度可平均上升25%～55%，同時患者的發(fā)病越急、治療敏感性越差或者治療預后越不佳，患者體內的Th2、Th17等指標的上升幅度越高。在不同的病情中，可以發(fā)現(xiàn)慢性期、亞急性期、急性期患兒Th1/Th2呈現(xiàn)出了逐漸下降的趨勢，而Th2、Th17等的濃度逐漸上升，一方面提示了T淋巴細胞免疫因子與濕疹患者的病情關系，同時也為臨床上濕疹患者的臨床預后評估提供潛在的參考指標[15]。最后，本次研究發(fā)現(xiàn)嗜酸性粒細胞、IgE水平等指標與患者的細胞免疫的關系較為密切，進一步提示了CD4+ T細胞水平與兒童濕疹的相關性。

綜上所述，濕疹小兒外周血中CD4細胞亞群失衡與濕疹有密切的相關性，mircoRNA-155表達變化不明顯。后續(xù)臨床研究應該增加對于T淋巴細胞在不同治療預后轉歸患兒中的臨床隨訪價值分析。

[參考文獻]

[1]Quaranta M，Knapp B，Garzorz N，et al.Intraindividual genome expression analysis reveals a specific molecular signature of psoriasis and eczema[J].Sci Transl Med，2014，6（244）：244-290.

[2]徐文博，沈立飛.Th細胞相關細胞因子水平與老年濕疹患者臨床特征的相關分析[J].中國皮膚性病學雜志，2016，30（12）：1230-1232.

[3]姚思敏，郭成成.嬰兒濕疹發(fā)病機制的研究進展[J].生物技術世界，2014，8（4）：64-65.

[4]胥興文，楊和榮，萬焰，等.嬰幼兒濕疹特異性IgG抗體檢測的臨床意義[J].國際檢驗醫(yī)學雜志，2016，37（15）：2175-2177.

[5]曹春育，帥茂圣，陳麗華，等.濕疹患者外周血淋巴細胞亞群分析及與C反應蛋白、血沉相關性研究[J].皮膚病與性病，2018，40（1）：63-65.

[6]West CE，Ryd NP，Lundin D，et al.Gut microbiome and innate immune response patterns in IgE-associated eczema[J].J Allergy Clin Immunol，2015，45（9）：1419-1429.

[7]鮑亞娟.小兒濕疹的臨床分析及健康教育研究[J].中國醫(yī)療美容，2015，5（2）：132-133.

[8]藺小培，嚴成明，張榴榴.復方黃柏液聯(lián)合丁酸氫化可的松乳膏治療嬰兒濕疹臨床觀察[J].安徽醫(yī)學，2015，36（3）：289-290.

[9]王彬，錢慶增，曹向可，等.濕疹嬰幼兒腸道菌群與免疫功能改變及相關性分析[J].中國煤炭工業(yè)醫(yī)學雜志，2017，20（10）：1135-1138.

[10]李曉輝，翁智勝，易江華，等.泛發(fā)性濕疹嗜酸粒細胞計數(shù)與IgE的相關性[J].中國麻風皮膚病雜志，2015，30（6）：358-359.

[11]李秋玲，朱敏儀，廖立新.臍血IgE及喂養(yǎng)干預對嬰兒濕疹發(fā)病的影響研究[J].吉林醫(yī)學，2016，37（1）：27-29.

[12]唐顯華，付小京，張志海，等.番禺地區(qū)909例蕁麻疹慢性濕疹過敏原檢測分析[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2014，30（8）：1129-1131.

[13]路雪艷，王德旭，蔣靖，等.濕疹皮炎患者過敏原特異性IgE檢測陽性結果的多中心研究[J].中華皮膚科雜志，2015，48（9）：616-620.

[14]Eyerich K，Eyerich S，Biedermann T.The Multi-modal immune pathogenesis of atopic eczema[J].Trends Immunol，2015，36（12）：788-801.

[15]李迎，張吉林，宋玉國.特應性皮炎患者外周血microRNA-155和CD4+T細胞檢測的臨床意義[J].中國免疫學雜志，2015，31（12）：

1679-1682.

[收稿日期]2018-05-02 [修回日期]2018-06-25

編輯/朱婉蓉