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    細(xì)菌一種“新的分泌機(jī)制”初探

    2011-05-29 10:16:10李澤鴻彭其勝
    中國獸藥雜志 2011年3期
    關(guān)鍵詞:信號肽氨基質(zhì)粒

    李澤鴻,彭其勝

    (1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,長春 130118;2.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,長春 130062)

    革蘭氏陰性細(xì)菌中已發(fā)現(xiàn)四種蛋白質(zhì)分泌途徑,稱為 I、II、III、IV 型分泌機(jī)制[1]。II和 IV 型是Sec系統(tǒng)依賴途徑(Sec基因編碼一些分泌途徑必需的Sec蛋白質(zhì),這些分泌途徑被稱為Sec依賴的分泌途徑)。蛋白質(zhì)被這兩種分泌途徑運(yùn)輸經(jīng)過細(xì)胞膜前,有一個獨立的跨過內(nèi)膜的步驟。II型和IV型分泌蛋白質(zhì)的共同之處在于外排到周質(zhì)時蛋白的氨基端上存在一個疏水信號序列。信號序列幫助蛋白質(zhì)分泌,當(dāng)分泌蛋白到達(dá)周質(zhì)時會被信號肽酶剪切掉[2]。I型是 Sec非依賴途徑。與II型和IV型分泌途徑相比較,I型和III型分泌不依賴于Sec系統(tǒng),所以不需要分泌蛋白的氨基端加工。I型和III型途徑的蛋白質(zhì)分泌是一個連續(xù)的過程,不存在明顯的周質(zhì)中間體[3-4]。

    重組蛋白在大腸桿菌胞周質(zhì)中分泌表達(dá)應(yīng)屬于II型分泌機(jī)制[2],在重組蛋白的氨基端通常融合一段信號肽基因,當(dāng)翻譯完成后,這條信號肽就會被大腸桿菌胞質(zhì)中的信號肽酶切除,這是一條傳統(tǒng)的分子生物學(xué)基本原理。但是,本文在構(gòu)建一種重組毒素DAB389(Gly4Ser)2-αMSH時,發(fā)現(xiàn)另一種原核胞周質(zhì)分泌表達(dá)機(jī)制:在該重組蛋白的前面沒有信號肽基因,卻能在胞周質(zhì)中分泌表達(dá)。為此將這種現(xiàn)象提出并做初步探討。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞 質(zhì)粒 pET28a(+)、pET20b(+)、Rosettablue(DE3)、BL21(DE3)pLysS購置于Novagen公司;pMD18T載體試劑盒購于大連寶生物公司;pET28a/DAB389(Gly4Ser)2-EGF質(zhì)粒由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所張國利博士惠贈;大腸桿菌JM105由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實驗室保存。

    1.1.2 工具酶及試劑 限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、PCR產(chǎn)物回收試劑盒均購自大連TaKaRa公司。誘導(dǎo)劑IPTG購自Merck公司,蛋白質(zhì)相對分子量標(biāo)準(zhǔn)購自上海生物化學(xué)研究所。Cu Chelating Sepharose Fast Flow親和層析設(shè)備及介質(zhì)購自瑞典Pharmacia Biotech公司。抗白喉毒素陽性血清為本實驗室保存,辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記鼠抗馬IgG為Sigma產(chǎn)品;PCR引物、寡核苷核片段的合成及DNA測序由大連TaKaRa公司承擔(dān)。

    1.1.3 PCR引物及寡核苷酸片段的設(shè)計 DAB389(Gly4Ser)2-αMSH上、下游引物分別為:

    1.2 方法

    1.2.1 DAB389(Gly4Ser)2- αMSH 基因片段的PCR擴(kuò)增 94℃預(yù)變性4 min,擴(kuò)增參數(shù):94℃ 40 s,50℃ 50 s,72℃ 60 s,7 個循環(huán),94℃ 40 s,60℃ 50 s,72℃ 60 s,30 個循環(huán);72℃延伸 10 min。

    1.2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 PCR產(chǎn)物純化后,置于 pMD18T載體,構(gòu)建 pMD18T-DAB389(Gly4Ser)2-αMSH質(zhì)粒,對質(zhì)粒進(jìn)行 Nco I和EcoR I雙酶切,得目的基因 DAB389(Gly4Ser)2-αMSH,與經(jīng)同樣雙酶切的pET28a(+)載體連接,得到融合蛋白表達(dá)載體 pET28a-DAB389(Gly4Ser)2-αMSH,篩選陽性克隆后測序鑒定,對pET28a-DAB389(Gly4Ser)2-αMSH 進(jìn)行 Nco I和EcoR I雙酶切,與經(jīng)同樣雙酶切的載體 pET20b(+)連接,得融合蛋白表達(dá)載體pET20b-DAB389(Gly4Ser)2-αMSH,篩選陽性克隆后測序鑒定。

    1.2.3 表達(dá)蛋白及 SDS-PAGE分析 分別將pET28a-DAB389(Gly4Ser)2-αMSH、pET20b-DAB389(Gly4Ser)2-αMSH轉(zhuǎn)化Rosettablue(DE3),用終濃度為1 mmol/L IPTG,37℃,3 h誘導(dǎo)表達(dá)。收集表達(dá)宿主菌,用10倍體積的蔗糖溶液(20%蔗糖,20 mmol/L Tris- Cl,2 mmol/L EDTA)懸浮菌體,4℃放置10 min,離心收集菌體,用4℃ 重蒸水懸浮菌體,4℃放置10 min,離心,取上清液SDSPAGE分析蛋白表達(dá)形式,然后收集表達(dá)宿主菌的原生質(zhì)體,超聲波裂解后SDS-PAGE分析蛋白表達(dá)形式。

    1.2.5 Cu Chelating Sepharose Fast Flow 親和層析純化目的蛋白 色譜柱填裝完成后,用起始緩沖液A平衡層析柱10~15個柱床,上樣,用起始緩沖液A洗脫流穿峰至基線平穩(wěn),以A(20 mmol/L Tris-Cl,0.5 mol/L NaCl,pH 7.5)→B(20 mmol/L Tris -Cl,0.5 mol/L NaCl,50 mmol/L 咪唑液,pH 7.5)進(jìn)行梯度洗脫,洗脫流速為3 mL/min,時間90 min。收集各組分峰成分進(jìn)行SDS-PAGE分析。

    1.2.6 DAB389(Gly4Ser)2- αMSH 中的信號肽分析 將DAB389(Gly4Ser)2-αMSH一級結(jié)構(gòu)輸入Technical University of Denmark 的 SignalP 3.0 Server,進(jìn)行信號肽序列分析。

    2 結(jié)果

    2.1 目的基因DAB389(Gly4Ser)2-αMSH片段的PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示:DAB389(Gly4Ser)2-αMSH基因片段為1278 bp,與預(yù)期的大小相符(圖1)。

    圖1 DAB389(Gly4Ser)2-αMSH基因的擴(kuò)增結(jié)果

    2.2 免疫毒素 DAB389(Gly4Ser)2-αMSH的兩種表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定 pET28a(+)和pET20b(+)同為Novagen的pET表達(dá)載體系列,后者帶有pelB leader信號肽,將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物插入載體pET28a(+)后,得 pET28a-DAB389(Gly4Ser)2-αMSH,經(jīng)Nco I和EcoR I雙酶切后,插入相同酶切的pET20b(+)即可得到 pET20b-DAB389(Gly4Ser)2-αMSH表達(dá)載體。DNA測序證實兩種表達(dá)載體插入的目的基因無堿基突變和讀碼框轉(zhuǎn)移。

    2.3 免疫毒素 DAB389(Gly4Ser)2-αMSH的表達(dá)與分析 兩種表達(dá)載體pET28a-DAB389(Gly4Ser)2-αMSH和pET20b-DAB389(Gly4Ser)2-αMSH分別轉(zhuǎn)化Rosetta(DE3)后,經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后,其中pET28a-DAB389(Gly4Ser)2-αMSH表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析(圖2),在Mr 46 000有一條明顯的條帶,與預(yù)期值相符;表達(dá)宿主菌經(jīng)過糖-水滲透溶脹后,取其上清進(jìn)行SDS-PAGE。結(jié)果表明,免疫毒素DAB389(Gly4Ser)2-αMSH以分泌細(xì)菌周質(zhì)形式表達(dá);pET20b-DT389-MSH表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析,結(jié)果表明,DAB389(Gly4Ser)2-αMSH不能表達(dá)。

    圖2 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析結(jié)果

    2.4 Western印跡分析 pET28a-DAB389(Gly4Ser)2-αMSH在Rosetta(DE3)中的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Western印跡分析檢測,在對應(yīng)于DAB389(Gly4Ser)2-αMSH處有明顯的蛋白雜交帶(圖3),說明產(chǎn)物為特異性蛋白。

    圖3 Western-Blot鑒定結(jié)果

    2.5 Cu Chelating Sepharose Fast Flow純化DAB389(Gly4Ser)2-αMSH 表達(dá)蛋白經(jīng)55%硫酸銨鹽析后,脫鹽,然后經(jīng)Cu Chelating Sepharose Fast Flow層析純化,分離的目的蛋白純度達(dá)到90.53%(圖4)。

    心理學(xué)家在研究創(chuàng)新思維的培養(yǎng)問題時指出∶“學(xué)生的學(xué)習(xí)動機(jī)和求知欲,不會自然涌現(xiàn),它取決于教師所創(chuàng)設(shè)的教學(xué)情況?!彼?,教師必須經(jīng)常地、有意識地為學(xué)生精心創(chuàng)設(shè)各種情景。

    圖4 DAB389(Gly4Ser)2-αMSH蛋白經(jīng)Cu Chelating Sepharose Fast Flow純化的結(jié)果

    2.6 DAB389(Gly4Ser)2- αMSH 性質(zhì)分析 通過SignalP 3.0 Server(Technical University of Denmark)分析DAB389(Gly4Ser)2-αMSH中的信號肽存在情況(圖5、表1),重組蛋白氨基端前70個氨基酸中不存在信號肽。

    圖5 DAB389(Gly4Ser)2-αMSH中信號肽的預(yù)測分析結(jié)果

    表1 DAB389(Gly4Ser)2-αMSH中信號肽的預(yù)測結(jié)果Sequence length=70

    通過另一種信號肽軟件SignalP-HMM分析,結(jié)果也同樣顯示在DAB389(Gly4Ser)2-αMSH的氨基端不存在信號肽。

    3 討論

    在本實驗中,Rosetta(DE3)表達(dá)宿主菌經(jīng)過糖-水滲透溶脹后,得原生質(zhì)體[5]。SDS-PAGE分析其周質(zhì)成分時,發(fā)現(xiàn) DAB389(Gly4Ser)2-αMSH分泌在細(xì)菌的周質(zhì)腔內(nèi),Western分析其表達(dá)蛋白也具有特異性,確系本文構(gòu)建的重組蛋白。由于用于表達(dá)的質(zhì)粒是pET28a,該質(zhì)粒是一種胞內(nèi)表達(dá)質(zhì)粒,表達(dá)基因插入在質(zhì)粒的Nco I和EcoR I之間,在起始密碼子(ATG)處根本不存在信號肽序列,而且通過Signal neural networks軟件(NN)分析重組蛋白的特性,發(fā)現(xiàn) DAB389(Gly4Ser)2-αMSH的氨基端也不存在信號肽序列。將這種現(xiàn)象與革蘭氏陰性細(xì)菌中已發(fā)現(xiàn)的四種蛋白質(zhì)分泌表達(dá)機(jī)制相比較,發(fā)現(xiàn)DAB389(Gly4Ser)2-αMSH分泌表達(dá)雖然與II、IV型分泌機(jī)制類似[4],都是將蛋白分泌到細(xì)菌的周質(zhì)腔中,但是由于 DAB389(Gly4Ser)2-αMSH的氨基端不含有信號肽,因此這種分泌機(jī)制不應(yīng)屬于II、IV型;I型和III型途徑的蛋白質(zhì)分泌是一個連續(xù)的過程,不存在明顯的周質(zhì)中間體,不依賴于Sec系統(tǒng),因此這種分泌機(jī)制也不應(yīng)屬于 I、III型[2-3],因此本文推測在革蘭氏陰性細(xì)菌中可能還存在另一種蛋白質(zhì)分泌機(jī)制。

    白喉棒狀桿菌毒素(Diphtheria toxin,DT)系白喉桿菌分泌胞外的蛋白質(zhì),由β-棒狀桿菌噬菌體所攜帶的tox基因整合于染色體而編碼的?;蛉L為2 200 bp,其中301~375 bp為信號肽基因,376~1980 bp編碼白喉毒素,從其基因特點和編碼蛋白質(zhì)性質(zhì)來看,它屬于I型分泌系統(tǒng),蛋白完成轉(zhuǎn)膜后,信號肽酶會將其自動切除[6]。本文構(gòu)建的免疫毒素DAB389(Gly4Ser)2-αMSH中的毒素部分DAB389為DT中除去受體結(jié)合區(qū)后所剩的成熟肽部分,不含信號肽。本實驗表明,在免疫毒素前面置入功能較強(qiáng)的信號肽pelB后,在大腸桿菌中反而不表達(dá) DAB389(Gly4Ser)2-αMSH,對這種現(xiàn)象學(xué)者們早有解釋:并不是在重組蛋白前加入信號肽就能導(dǎo)致其分泌表達(dá),它只是一個必要條件,要分泌表達(dá)還與其他因素有關(guān)。例如,氨基端前20~30個氨基酸的疏水性、正電荷的分布及宿主菌的性質(zhì)等影響蛋白的分泌表達(dá)[7-8]。但對于 DAB389(Gly4Ser)2-αMSH在胞內(nèi)表達(dá)質(zhì)粒中分泌表達(dá)這種現(xiàn)象至今尚無人涉及,作者認(rèn)為:可能在DAB389(Gly4Ser)2-αMSH的氨基端含有類似信號肽功能的序列,在蛋白表達(dá)中起信號肽的作用,引導(dǎo)蛋白進(jìn)入細(xì)菌周質(zhì)腔內(nèi);而且,這條類似信號肽的序列在轉(zhuǎn)膜完成后不被切除,因為從目前銅離子親和層析純化結(jié)果來看,DAB389(Gly4Ser)2-αMSH前引入的His·Tag序列并未被切除,如果被切除,純化的效果不會如此明顯。

    總之,無論上述解釋和推測正確與否,但是本實驗發(fā)現(xiàn)的這種現(xiàn)象很有意義,以期引起學(xué)者們的思考。

    參教文獻(xiàn):

    [1]王 健,趙立平.細(xì)菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)[J].生命的化學(xué),2001,21(2):147-149.

    [2]Kakizawa S,Oshima K,Nishigawa H,et al.Secretion of Immunodominant Membrane Protein from Onion Yellows Phytoplasma through the Sec Protein-translocation System in Escherichia coli[J].Microbiology,2004,150:135 -142.

    [3]Holland I B,Schmitt L,Young J.Type 1 Protein Secretion in Bacteria,the ABC -transporter Dependent Pathway(Review)[J].Mol Membr Biol,2005,22(1/2):29 -39.

    [4]Stuber K,F(xiàn)rey J,Burnens A P,et al.Detection of Type III Secretion Genes as a General Indicator of Bacterial Virulence[J].Mol Cell Probes,2003,17(1):25 -32.

    [5]Lavely W C,Scarfone C,Cevikalp H,et al.Phantom Validation of Coregistration of pET and CT for Image-guided Radiotherapy[J].Med Phys,2004,31(5):1083 -1092.

    [6]Kaczorek M,Delpeyroux F,Chenciner N,et al.Nucleotide Sequence and Expression of the Diphtheria Toxin 228 Gene in Escherichia coli[J].Science,1983,221(4613):855 -858.

    [7]Engelman D M,Steitz T A.The Spontaneous Insertion of Protein into and across Membranes:the Helical Hairpin Hydrothesis[J].Cell,1981,23(2):411 -422.

    [8]Davis N G,Model P.An Artificial Anchor Domain:Hydrophobicity Suffices to Stop Transfer[J].Cell,1985,41:607 -614.

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