禽呼腸孤病毒ZJS株種毒的純凈性鑒定

李慧姣，李俊平，楊承槐，李啟紅，張曉南，黃建華

(1.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081;2.廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司，廣東新興 527400)

病毒性關(guān)節(jié)炎/腱鞘炎是由呼腸孤病毒(Reovirus，REOV)引起的雞特別是肉雞的重要傳染?。?］。病毒主要侵害雞的關(guān)節(jié)滑膜、腱鞘和心肌，引起足部關(guān)節(jié)腫脹，腱鞘發(fā)炎，繼而使腓腸腱斷裂。病雞表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫脹、發(fā)炎，行動(dòng)不便，不愿走動(dòng)或跛行，采食困難，生長(zhǎng)停滯等。已從病毒性關(guān)節(jié)炎/腱鞘炎、矮小綜合征、呼吸道疾病、腸道疾病及吸收不良綜合征和骨質(zhì)疏松癥等病雞的許多組織中分離到該病毒。REOV感染的雞群常因跛行(病毒性關(guān)節(jié)炎/腱鞘炎)和包括增重減少、飼料利用率降低、死亡等總體生產(chǎn)性能低下，降低了雞的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

為了開(kāi)發(fā)用于雛雞病毒性關(guān)節(jié)炎/腱鞘炎的活疫苗，在前期進(jìn)行種毒傳代和鑒定的基礎(chǔ)上［2］，擬對(duì)引進(jìn)的REOV ZJS株細(xì)胞毒(弱毒)按照現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》［3］進(jìn)行純凈性鑒定，以建立病毒性關(guān)節(jié)炎活疫苗的種子批供疫苗生產(chǎn)使用。

1 材料和方法

1.1 病毒 呼腸孤病毒 ZJS株(弱毒)C1～C3、C5、C8和C10代細(xì)胞毒，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制備、保存。

1.2 SPF雞 7日齡，購(gòu)自北京梅里亞維通公司。在本所SPF試驗(yàn)動(dòng)物房正壓隔離器內(nèi)飼養(yǎng)供試驗(yàn)使用。

1.3 診斷用抗原及抗體

1.3.1 瓊脂擴(kuò)散(AGP)抗原和陽(yáng)性血清 包括馬立克氏病病毒(MDV)、雞痘病毒(FPV)、傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)、雞傳染性法氏囊病病毒(IBDV)、禽腺病毒(FADV)、禽呼腸孤病毒(REOV)等AGP抗原和陽(yáng)性血清，均由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制備。

1.3.2 血凝抑制(HI)抗原及標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清 包括禽流感病毒(AIV)H5、H9亞型，新城疫病毒(NDV)和減蛋綜合征病毒(EDSV)等HI抗原及標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，均購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所。

1.3.3 ELISA檢測(cè)試劑盒 包括禽白血病病毒(ALV)、禽腦脊髓炎病毒(AEV)、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(REV)、雞傳染性法氏囊病病毒(IBDV)、雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)、禽呼腸孤病毒(REOV)和雞傳染性貧血病毒(CAV)等ELISA檢測(cè)試劑盒(每種試劑盒內(nèi)含已包被好的酶標(biāo)板、陽(yáng)性血清對(duì)照、陰性血清對(duì)照、稀釋液、酶標(biāo)抗體、樣品稀釋液、底物、終止液和洗滌液)，均購(gòu)自IDEXX公司。

1.3.4 陰性血清 SPF雞血清，本所制備。

1.4 無(wú)菌檢驗(yàn) 按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》規(guī)定方法進(jìn)行檢驗(yàn)。

1.5 支原體檢驗(yàn) 按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》規(guī)定方法進(jìn)行檢驗(yàn)。

1.6 外源病毒檢驗(yàn) 由于制備的REOV陽(yáng)性血清不能完全中和10羽份(≥104.5TCID50)的種毒，故采用現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》規(guī)定方法中的SPF雞檢驗(yàn)法進(jìn)行。

1.6.1 接種方法 用7日齡SPF雞20只，點(diǎn)眼、滴鼻接種10羽份(0.1 mL)，腿部肌肉注射100羽份(1 mL/只)，同時(shí)設(shè)一組10只非免疫對(duì)照組。觀察21 d后，按上述方法和劑量重復(fù)接種1次。第1次接種后42 d或第2次接種后21 d采血，分離血清。在42 d內(nèi)，不應(yīng)有疫苗引起的局部或全身癥狀和呼吸道癥狀或死亡。如果有死雞，應(yīng)進(jìn)行病理學(xué)檢查，以證明是否由REOV ZJS株種毒所致。

1.6.2 檢查的外源病毒及其檢驗(yàn)方法 對(duì)分離的血清用HI檢驗(yàn)方法測(cè)定雞新城疫病毒、H5亞型禽流感病毒、H9亞型禽流感病毒和減蛋綜合癥病毒抗體;用ELISA方法測(cè)定雞傳染性支氣管炎病毒、雞傳染性貧血病毒、禽白血病病毒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒、雞傳染性法氏囊病病毒、禽呼腸孤病毒和禽腦脊髓炎病毒的抗體;用AGP方法進(jìn)行雞傳染性法氏囊病病毒、禽呼腸孤病毒、雞馬立克氏病病毒、腺病毒、雞傳染性喉氣管炎病毒和雞痘病毒的抗體檢測(cè)。

1.6.3 結(jié)果判定

1.6.3.1 ELISA方法的判定 按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。AEV、ALV、IBDV、IBV、REOV 樣品的 S/P 值小于或等于0.2，判為陰性;樣品的S/P值大于0.2，判為陽(yáng)性［S/P值=(樣品值－陰性對(duì)照值)/(陽(yáng)性對(duì)照值－陰性對(duì)照值)］。REV樣品的S/P值小于或等于0.5，判為陰性;樣品的 S/P 值大于0.5，判為陽(yáng)性。CAV樣品的S/N值(樣品值/陰性對(duì)照值)大于0.6，判為陰性;樣品的S/N值小于或等于0.6，判為陽(yáng)性。

1.6.3.2 AGP方法的判定 原倍血清出現(xiàn)沉淀線即判為陽(yáng)性。

1.6.3.3 HI方法的判定 NDV、EDSV、AIV － H5亞型和H9亞型HI抗體≥1∶4，判為陽(yáng)性。

1.7 特異性鑒定 將REOV ZJS株 C3、C8和C10代種毒用雞馬立克氏病疫苗稀釋液(SPG)作10倍系列稀釋，取10－3～10－7分別與等量原倍陽(yáng)性血清混合，37℃左右中和1 h，接種已長(zhǎng)成CEF單層細(xì)胞的96孔或48孔細(xì)胞板，每孔接種0.2 mL，每個(gè)滴度接種5孔，同時(shí)取10－5～10－8未經(jīng)中和的病毒對(duì)照，接種細(xì)胞，每孔接種0.1 mL，37℃左右 CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)觀察5 d，判定結(jié)果采用Reed－Muench法分別計(jì)算未中和的疫苗滴度與抗體中和后的疫苗滴度，用TCID50表示，兩者的比值即為中和指數(shù)，中和指數(shù)應(yīng)≥102。

2 結(jié)果

2.1 無(wú)菌檢驗(yàn) REOV ZJS株C1、C2和 C3代種毒無(wú)菌檢驗(yàn)結(jié)果均為陰性，表明種毒未污染細(xì)菌和真菌。

2.2 支原體檢驗(yàn) REOV ZJS株 C1、C2和 C3代種毒支原體檢驗(yàn)結(jié)果均為陰性，表明種毒未污染支原體。

2.3 外源病毒檢驗(yàn) REOV ZJS株C5、C8和 C10代種毒兩次接種雛雞后，42 d采血，進(jìn)行血清抗體檢測(cè)，種毒除產(chǎn)生禽呼腸孤病毒特異性抗體外，其他病原抗體檢測(cè)均為陰性。在42 d內(nèi)，種毒未引起局部或全身癥狀和呼吸道癥狀或死亡(表1)。

表1 REOV ZJS株種毒外源病毒檢測(cè)方法與結(jié)果

2.4 特異性鑒定 REOV ZJS株C3、C8和C10代種毒經(jīng)特異性陽(yáng)性血清中和后，接種96孔板CEF中，培養(yǎng) 5 d，中和指數(shù)分別為 102.88、102.67和 103.0(≥102.0)。結(jié)果如表2所示。

表2 REOV ZJS株C種毒特異性鑒定

3 討論與小結(jié)

保持病毒性活疫苗種毒的純凈性和特異性，對(duì)于保證產(chǎn)品的質(zhì)量有著重要意義，種毒中污染外源病毒，則產(chǎn)品中必然會(huì)污染相應(yīng)病毒，不但影響產(chǎn)品的質(zhì)量，還能傳播病毒，造成散毒和其他傳染病的傳播。國(guó)內(nèi)有從禽用活疫苗中分離出網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病病毒(REV)的報(bào)道［4］。崔治中等報(bào)道近年來(lái)我國(guó)雞群免疫抑制性綜合癥越來(lái)越常見(jiàn)，并從江蘇、山東某雞場(chǎng)出現(xiàn)的典型病例中檢測(cè)出REV和雞貧血病毒(CAV)［5－6］，這些是否與使用污染了的疫苗有關(guān)尚待證實(shí)。國(guó)外也有報(bào)道使用REV污染的禽痘疫苗或MD活疫苗造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［7－8］。澳大利亞最早報(bào)道接種火雞皰疹病毒(HVT)后出現(xiàn)腺胃炎和網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥，后來(lái)又報(bào)道蛋雞群在接種被REV污染的MD疫苗后發(fā)生組織細(xì)胞性淋巴肉瘤［9］。本研究結(jié)果表明，呼腸孤病毒ZJS株種毒(細(xì)胞毒)未污染細(xì)菌、霉菌、支原體及外源病毒，純凈性和特異性各項(xiàng)鑒定結(jié)果均符合病毒活疫苗用生產(chǎn)毒種的相關(guān)規(guī)定［2］，可以作為病毒性關(guān)節(jié)炎活疫苗生產(chǎn)用種毒。

致謝:無(wú)菌檢驗(yàn)和支原體檢驗(yàn)項(xiàng)均由本所細(xì)菌制品檢測(cè)室完成，在此，表示衷心的感謝!

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