酶法輔助提取生姜姜辣素及其對(duì)山茶油抗氧化作用研究

沈玉平, 劉 玉, 謝依帆, 何春蘭, 張祖姣

(湖南南嶺地區(qū)植物資源研究開(kāi)發(fā)湖南省工程研究中心,湖南省銀杏工程技術(shù)研究中心,湖南科技學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院,永州 425199)

姜(ZingiberofficinaleRoscoe),多年生姜科姜屬草本植物,是我國(guó)常見(jiàn)的藥食同源植物。生姜是姜的新鮮根莖,不僅是我國(guó)居民非常喜愛(ài)的調(diào)味品,也是重要的傳統(tǒng)藥材,具有解表散寒、溫肺止咳、溫中止吐、發(fā)汗、解毒等功效[1]。姜辣素是生姜的主要活性成分,它不僅是生姜辣味的呈味物質(zhì),更是生姜各種藥理作用的活性功能因子[2]。姜辣素有益于抗氧化[3]、抗腫瘤[4]、抗炎[5]、降血脂血壓[6]、美白護(hù)膚[7]等,廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、營(yíng)養(yǎng)保健品和醫(yī)藥行業(yè)。

目前,姜辣素的主要來(lái)源是生姜提取,常用提取方法包括溶劑提取法、超聲波輔助提取法、酶輔助提取法以及協(xié)同提取法[8]。但是,超聲波輔助及微波輔助提取易破壞其生物活性,而酶反應(yīng)條件溫和,特異性強(qiáng),可有效地破壞生姜細(xì)胞結(jié)構(gòu),加速姜辣素溶出,降低傳質(zhì)阻力,提高提取效率,并能有效保持提取物的生物活性,因而酶輔助法提取姜辣素日益受到大家的青睞[9, 10]。通過(guò)選用不同的酶,如纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、蛋白酶等水解破壞生姜細(xì)胞壁,研究者成功提高了姜辣素的提取率[8, 11-13],此外聯(lián)合使用2種或以上的細(xì)胞壁水解酶,如纖維素酶與半纖維素酶[14]、葡萄糖苷酶[15]或果膠酶[16]的聯(lián)合,進(jìn)一步提高了姜辣素的提取率。但是,細(xì)胞壁并非姜辣素溶出的唯一障礙,生姜中淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)50.79%,大量的淀粉顆粒與細(xì)胞壁中的木質(zhì)纖維素緊密纏繞在一起,影響姜辣素的傳質(zhì)速率,進(jìn)而影響姜辣素的提取效率[17, 18]。并且Agendra等[10]和Amiri等[19]發(fā)現(xiàn),淀粉酶輔助處理的姜辣素提取率高于纖維素酶輔助處理時(shí)的提取率。為此,研究選用淀粉酶和纖維素酶,分別作用于淀粉顆粒和細(xì)胞壁,考察二者對(duì)姜辣素提取的協(xié)同作用,以高效提取姜辣素。

山茶油是我國(guó)特有的高品質(zhì)木本植物油,其不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過(guò)90%(油酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過(guò)80%)。山茶油在儲(chǔ)存過(guò)程中易氧化,不僅影響山茶油的風(fēng)味和色澤,還會(huì)伴隨產(chǎn)生一些人體有毒有害物質(zhì),嚴(yán)重影響山茶油的品質(zhì)和安全性[20]。添加食品抗氧化劑,如二丁基羥基甲苯(BHT)、丁基羥基茴香醚(BHA)、特丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)等,可以有效地緩解山茶油的氧化。但化學(xué)抗氧化劑具有潛在的毒副作用,植物源天然抗氧化劑綠色安全,替代化學(xué)抗氧化劑已是大勢(shì)所趨,也是未來(lái)食品抗氧化劑的發(fā)展方向[21]。

生姜作為我國(guó)居民廣為接受和喜愛(ài)的傳統(tǒng)調(diào)味品,其安全性毋庸置疑。姜辣素提取物與山茶油色澤接近,以姜辣素提取物作為山茶油抗氧化劑,不僅有利于抑制山茶油氧化變質(zhì),還可以調(diào)節(jié)油脂色澤,增加油脂風(fēng)味,提高山茶油品質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化酶輔助溶劑浸提法提取生姜姜辣素,并通過(guò)Schaal烘箱法研究其對(duì)山茶油的抗氧化作用,可為山茶油的儲(chǔ)藏保質(zhì)提供一種簡(jiǎn)便有效的策略。研究不僅為姜辣素對(duì)山茶油的抗氧化研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù),還可有效促進(jìn)生姜的綜合利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生姜、山茶油;6-姜酚(6-gingerol)、8-姜酚(8-gingerol)、10-姜酚(10-gingerol)、6-姜烯酚(6-shogaol)、BHT;纖維素酶(20 000 U/g)、淀粉酶(含有α-淀粉酶和糖化酶,20 000 U/g);乙腈、甲醇,色譜級(jí);乙醇、磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、硫代硫酸鈉(Na2S2O3·5H2O)等均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 主要儀器設(shè)備

LC20-AT高效液相色譜儀,DX-30B超微粉碎機(jī),RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,DHG-9053A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,5810R冷凍離心機(jī),PHS-3C型pH計(jì)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 姜辣素的提取及工藝條件優(yōu)化

將生姜洗凈去皮,切成厚度1 mm左右的薄片,50 ℃烘箱干燥至恒重(約36 h),粉碎過(guò)60目篩,可得干姜粉。姜辣素提取步驟:1)酶預(yù)處理:精確稱(chēng)取2.00 g干燥姜粉,加入到含有10～50 mg淀粉酶或纖維素酶的20 mL pH 4.5～6.5的磷酸緩沖液中,40～60 ℃恒溫水浴酶解0.5～2.5 h,然后70 ℃水浴滅活25 min;2)乙醇浸提:在酶預(yù)處理樣品中加入30 mL無(wú)水乙醇,60 ℃恒溫浸提1.5 h后,3 000 r/min離心10 min,收集上清液備用,隨后在沉淀中分別加入體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇50 mL按照操作進(jìn)行2次提取,合并3次提取的上清液,抽濾收集濾液,濾液于50 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮去除溶劑,即可得姜辣素提取物。

實(shí)驗(yàn)中,通過(guò)改變酶用量、酶配比、酶解溫度、酶解pH以及酶解時(shí)間進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化,并在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化,以獲取最優(yōu)的工藝條件,每次實(shí)驗(yàn)3個(gè)平行。其中,對(duì)照組為不經(jīng)酶處理,直接利用乙醇提取姜辣素實(shí)驗(yàn)組。

1.3.2 姜辣素高效液相色譜分析條件

姜辣素是生姜中所有辣味物質(zhì)的總稱(chēng),其主要成分為6-姜酚,其次為8-姜酚、10-姜酚和6-姜烯酚。姜辣素含量的測(cè)定在陳可可等[22]檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化,通過(guò)高效液相色譜儀進(jìn)行。分析條件:SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器,Inertsil ODS-SP C18反相柱(Shimadu GL Inertsil ODS-SP 250 mm×4.6 mm, 5 μm),流動(dòng)相A為超純水,流動(dòng)相B為乙腈,流速1.0 mL/min,進(jìn)樣體積10 μL,檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm,柱溫30 ℃。采用梯度洗脫方法分析姜辣素,洗脫程序?yàn)?～6 min,體積分?jǐn)?shù)55%～65% B;6～25 min,體積分?jǐn)?shù)65%～80% B;25～30 min,體積分?jǐn)?shù)80%～55% B,在此條件下,6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚和6-姜烯酚可以較好分離(圖1)。

圖1 4種姜辣素標(biāo)準(zhǔn)品混合液高效液相色譜圖

1.3.3 姜辣素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作

精密稱(chēng)取6-姜酚標(biāo)準(zhǔn)品10.16 mg、8-姜酚10.08 mg、10-姜酚標(biāo)準(zhǔn)品9.83 mg、6-姜烯酚標(biāo)準(zhǔn)品10.11 mg,分別用色譜級(jí)無(wú)水甲醇超聲溶解,并定容至10 mL,作為標(biāo)準(zhǔn)品母液,4 ℃避光保存?zhèn)溆谩７謩e吸取6-姜酚母液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL于10 mL的容量瓶中,以無(wú)水甲醇定容,按照1.3.2的分析方法進(jìn)行分析測(cè)定,以質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo),峰面積(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),并進(jìn)行線(xiàn)性回歸得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程,回歸方程見(jiàn)表1。

表1 姜辣素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性回歸方程

1.3.4 提取物姜辣素的測(cè)定

取少量姜辣素提取物,以甲醇稀釋適當(dāng)倍數(shù),吸取2 mL用0.45 μm PTFE針式疏水過(guò)濾器過(guò)濾,按照1.3.2中的方法進(jìn)行測(cè)定,并按照相應(yīng)回歸方程和提取液體積,分別計(jì)算6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚的質(zhì)量濃度,姜辣素的總質(zhì)量按照公式計(jì)算。

m0=(c6-姜酚+c8-姜酚+c10-姜酚+c6-姜烯酚)×V

式中:m0為提取物姜辣素總質(zhì)量;c6-姜酚、c8-姜酚、c10-姜酚、c6-姜烯酚分別為6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚的質(zhì)量濃度;V為提取液體積。

經(jīng)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后的姜辣素提取物,6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚和6-姜烯酚的質(zhì)量濃度分別為86.80、32.98、13.72、12.82 mg/mL,因此總的姜辣素質(zhì)量濃度為146.32 mg/mL。

1.3.5 姜辣素提取率的測(cè)定

樣品姜辣素的提取率按照以下公式計(jì)算。

式中:m0為提取物姜辣素總質(zhì)量;m為提取所用姜粉的總質(zhì)量。

1.3.6 姜辣素提取物對(duì)山茶油的抗氧化作用

采用Schaal烘箱法研究姜辣素提取物對(duì)山茶油的抗氧化作用。按照1.3.4中測(cè)定的姜辣素質(zhì)量濃度,將姜辣素提取物稀釋成姜辣素質(zhì)量濃度為500 μg/mL的母液,精確稱(chēng)取50.00 g山茶油置于廣口瓶中,分別加入100、200、300、400、500、600 μL姜辣素母液,調(diào)整姜辣素含量分別為50、100、150、200、250、300 μg/50 g山茶油,充分混勻,以不添加任何抗氧化劑的山茶油為空白對(duì)照,以化學(xué)抗氧化劑BHT(300 μg/50 g山茶油)為陽(yáng)性對(duì)照,置于(65±1)℃鼓風(fēng)干燥箱中,每隔3 d取樣測(cè)定樣品的過(guò)氧化值(POV),每個(gè)處理3個(gè)平行。POV參照GB 5009.227—2016《食品中過(guò)氧化值的測(cè)定》[23],采用滴定法測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 26.0進(jìn)行顯著性差異和方差分析,P<0.05定義為顯著,P<0.01定義為極顯著,采用Origin 9.0進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶用量對(duì)姜辣素提取的影響

考察淀粉酶和纖維素酶用量均為0、5、10、15、20、25、30、35 mg/g干姜粉時(shí),對(duì)姜辣素提取率的影響,確定酶的最佳用量,結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 酶用量對(duì)姜辣素提取率的影響

利用酶輔助處理可大大提高姜辣素提取率,隨著淀粉酶和纖維素酶用量的增加,姜辣素提取率逐步上升,并同時(shí)在25 mg/g時(shí)達(dá)到峰值(3.85±0.07)%和(3.66±0.06)%,較對(duì)照分別提高43.13%、38.63%。因此,最佳酶用量為25 mg/g干姜粉。Nagendra等[10]和Varakumar等[15]研究發(fā)現(xiàn),酶處理可大幅度提高姜辣素提取率,這與本研究結(jié)果一致。這是因?yàn)樯闹饕煞譃榈矸?其次為木質(zhì)纖維素和果膠,并且胞外的淀粉顆粒與細(xì)胞壁木質(zhì)纖維素緊密纏繞,因而阻止胞內(nèi)活性成分的溶出[17, 24]。淀粉酶、纖維素酶、蝸牛酶、蛋白酶、果膠酶等酶處理可以專(zhuān)一性地水解淀粉和纖維素、果膠、蛋白質(zhì)等細(xì)胞壁組分,有效破壞生姜的細(xì)胞結(jié)構(gòu),促進(jìn)活性物質(zhì)溶出,從而提高提取效率。Nagendra等[10]分別利用α-淀粉酶、纖維素酶、復(fù)合多糖酶、蛋白酶和果膠酶預(yù)處理干姜粉,使姜辣素提取率分別較對(duì)照分別提高90.0%、58.5%、90.0%、21.8%、60.0%;Amiri等[19]使用α-淀粉酶預(yù)處理干姜粉,使姜辣素和生姜多酚提取率分別提高2.8、2.2倍,本研究使用淀粉酶和纖維素酶亦同樣使姜辣素提取率分別提高43.13%和38.63%。

酶用量較低時(shí),水解不完全,因此提取率隨酶用量的增加持續(xù)上升。當(dāng)達(dá)到最佳酶用量25 mg/g時(shí),水解反應(yīng)比較完全,提取率達(dá)到峰值。王琛等[14]利用纖維素酶和半纖維素酶輔助提取姜辣素時(shí)亦發(fā)現(xiàn),一定范圍內(nèi)酶量的增加可提高姜辣素提取率,這與本研究的結(jié)果一致。當(dāng)酶用量大于25 mg/g時(shí),繼續(xù)加大酶用量對(duì)姜辣素提取率無(wú)實(shí)質(zhì)性影響,因?yàn)槊笣舛冗_(dá)到一定值后,底物已經(jīng)被充分飽和,繼續(xù)提高酶濃度并不能提高催化效率。此外,相同酶濃度條件下,淀粉酶的提取率均高于纖維素酶,Nagendra等[10]研究證實(shí),淀粉酶輔助處理的姜辣素提取率高于纖維素酶處理。這是由于生姜中淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)(50.79%)顯著高于纖維素(3.84%),胞外覆蓋大量的淀粉顆粒,并與細(xì)胞壁中的木質(zhì)纖維素緊密纏繞在一起,是姜辣素溶出的重要障礙[17, 18]。淀粉酶能有效地水解淀粉,可解除姜辣素溶出的障礙,因而導(dǎo)致提取率提高。

2.2 淀粉酶與纖維素酶對(duì)姜辣素提取的協(xié)同作用

鑒于淀粉酶可水解胞外覆蓋的淀粉顆粒,纖維素酶可水解細(xì)胞壁的主要成分木質(zhì)纖維素,因此二者聯(lián)用可能更有效地破壞生姜細(xì)胞結(jié)構(gòu),降低姜辣素的傳質(zhì)阻力,提高姜辣素提取效率。為此,考察了不同淀粉酶和纖維素酶復(fù)合酶用量以及不同配比情況下對(duì)姜辣素提取率的影響,結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同淀粉與纖維素酶配比及濃度對(duì)姜辣素提取率的影響

淀粉酶和纖維素酶對(duì)姜辣素的提取具有良好的協(xié)同作用,除1∶4配比外,相同的酶用量,復(fù)合酶的提取率均高于單一酶,并且1∶4配比復(fù)合酶提取率仍高于相同酶用量的單一纖維素酶提取率;而在提取率相當(dāng)?shù)那闆r下,復(fù)合酶用量顯著減少。復(fù)合酶配比為3∶2時(shí)效果最好,15 mg/g時(shí)即達(dá)到峰值(3.95±0.07)%,稍高于單一酶處理的最大提取率,但酶用量減少40%。生姜細(xì)胞外覆蓋大量的淀粉顆粒,并與細(xì)胞壁中的木質(zhì)纖維素緊密纏繞在一起,與細(xì)胞壁構(gòu)成了生姜胞內(nèi)活性物質(zhì)溶出的雙重障礙。因此,多酶聯(lián)合處理對(duì)生姜生物活性物質(zhì)的提取往往具有良好的協(xié)同作用。例如,王琛等[14]聯(lián)合使用纖維素酶和半纖維素酶,使姜辣素提取率較溶劑提取法提高了30%;Varakumar等[15]通過(guò)纖維素酶和葡萄糖苷酶輔助處理,使6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚和6-姜烯酚提取效率分別提升64.10%、87.80%、62.78%、32.00%;喻書(shū)誠(chéng)等[18]研究發(fā)現(xiàn)果膠酶和纖維素酶聯(lián)合作用,對(duì)黃姜皂素的提取具有良好的協(xié)同作用,這與本研究的結(jié)果類(lèi)似。因此正交實(shí)驗(yàn)中采用淀粉酶∶纖維素酶=3∶2的配比,15 mg/g的酶用量。

現(xiàn)在我是第一代身份證——沒(méi)用啦，每天寫(xiě)寫(xiě)字，鉆鉆牛角尖，把自己整得像教授一樣。那些年可忙壞啦，縣里鎮(zhèn)里是把我當(dāng)?shù)湫蛠?lái)培養(yǎng)的，三四年功夫當(dāng)?shù)叫ｉL(zhǎng)。嘿嘿，不過(guò)呢，當(dāng)教務(wù)主任時(shí)，沒(méi)有副校長(zhǎng)和校長(zhǎng)；當(dāng)副校長(zhǎng)時(shí)，既沒(méi)有校長(zhǎng)也沒(méi)有教務(wù)主任；當(dāng)校長(zhǎng)后，副校長(zhǎng)和教務(wù)主任都沒(méi)了。村小嘛。

2.3 酶解溫度對(duì)姜辣素提取的影響

本研究所用淀粉酶和中性纖維素酶為真菌來(lái)源酶,在40～60 ℃溫度范圍內(nèi)較穩(wěn)定。為此,考察了40、45、50、55、60 ℃條件下酶解處理對(duì)姜辣素提取率的影響,結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 酶解溫度、pH和時(shí)間對(duì)姜辣素提取率的影響

隨著溫度的提高,姜辣素提取率持續(xù)上升,55 ℃時(shí)達(dá)到峰值,此后下降。周泊寧等[11]和徐麗萍等[25]在纖維素酶輔助超聲提取姜辣素的研究中發(fā)現(xiàn),溫度升高有利于提高姜辣素提取率,但到達(dá)峰值后繼續(xù)提高溫度,將導(dǎo)致姜辣素提取率下降,這與本研究結(jié)果類(lèi)似。這是由于溫度較低時(shí),酶解作用不徹底,隨著溫度的升高,酶活性增強(qiáng),胞外的淀粉顆粒和細(xì)胞壁中的木質(zhì)纖維素水解速度加快,對(duì)生姜細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞作用增強(qiáng);此外,溫度的升高,分子運(yùn)動(dòng)速度加快,傳質(zhì)速率亦加快,而且高溫可導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,因而更利于姜辣素溶出,提高提取率[26]。但是,當(dāng)酶處理溫度提高至60 ℃時(shí),姜辣素提取率下降,這是因?yàn)楦邷貤l件下,酶的穩(wěn)定性減弱,逐漸失活,導(dǎo)致水解效果削弱。此外,Bhattarai等[27]研究發(fā)現(xiàn),姜辣素在水相中60 ℃即開(kāi)始降解,從而導(dǎo)致姜辣素提取率下降。因此,正交實(shí)驗(yàn)的酶解溫度選擇55 ℃。

2.4 酶解pH對(duì)姜辣素提取的影響

本研究所用淀粉酶和中性纖維素酶分別在pH 4.0～8.0和4.5～6.5范圍內(nèi)較穩(wěn)定,因此考察了pH 4.5、5.0、5.5、6.0和6.5環(huán)境條件下,酶解處理對(duì)姜辣素提取率的影響,結(jié)果如圖3所示。

隨著pH值的上升,姜辣素提取率逐步提高,酶解pH為5.5時(shí)達(dá)到峰值,隨后下降,說(shuō)明pH5.5時(shí),酶水解效果最佳,最利于破壞生姜細(xì)胞結(jié)構(gòu),釋放姜辣素。徐麗萍等[25]、裴小娜等[28]和李曉等[29]分別在利用纖維素酶輔助提取姜辣素、生姜揮發(fā)油和生姜精油時(shí)亦發(fā)現(xiàn),在一定pH值范圍內(nèi),提取率隨pH的提高而上升,但是繼續(xù)提高pH值時(shí),提取率下降,可能是由于pH的升高,影響了酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)的解離,使酶蛋白的構(gòu)象發(fā)生變化,降低了底物分子與酶活性中心的結(jié)合力和催化效率,從而影響姜辣素的提取率。因此,正交實(shí)驗(yàn)的pH值選擇5.5。

2.5 酶解時(shí)間對(duì)姜辣素提取的影響

酶解時(shí)間關(guān)系到生姜細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞是否充分,對(duì)姜辣素提取率有重要的影響。為此,考察了0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h酶處理時(shí)間對(duì)姜辣素提取效率的影響。從圖3可以看出,姜辣素提取率隨酶解時(shí)間的增加,先上升后下降,在1.0 h時(shí)達(dá)到峰值,徐麗萍等[25]和譚索等[30]利用纖維素酶輔助提取姜辣素和姜黃素也得到了類(lèi)似的結(jié)果。酶解時(shí)間過(guò)短,水解不充分,姜辣素?zé)o法充分溶出,因而提取率較低。酶解超過(guò)1 h后,繼續(xù)延長(zhǎng)酶解時(shí)間,提取率開(kāi)始下降,這是因?yàn)殡S著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),底物濃度降低,酶活力下降,并且生成的產(chǎn)物或占據(jù)酶催化部位,或與酶結(jié)合形成復(fù)合體,從而導(dǎo)致酶催化效率降低[31]。此外,長(zhǎng)時(shí)間浸泡也會(huì)導(dǎo)致其他雜質(zhì)一并溶出,高溫下與姜辣素相互作用,因而導(dǎo)致姜辣素含量下降[27]。因此,正交實(shí)驗(yàn)選擇1 h的酶解時(shí)間。

2.6 正交實(shí)驗(yàn)

2.6.1 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化姜辣素提取工藝條件

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,按照淀粉酶∶纖維素酶=3∶2的比例,選擇復(fù)合酶用量(A)、酶解溫度(B)、酶解pH(C)和酶解時(shí)間(D)4個(gè)因素作為考察對(duì)象,優(yōu)化姜辣素提取工藝條件,以提高提取率。正交因素水平設(shè)計(jì)表見(jiàn)表3,正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表4,方差分析見(jiàn)表5。

表3 正交設(shè)計(jì)表

表4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與統(tǒng)計(jì)分析

表5 正交實(shí)驗(yàn)方差分析

極差值的大小反映了各因素對(duì)姜辣素提取率的影響,從表4可以看出,各因素對(duì)姜辣素提取率的影響為復(fù)合酶用量(A)>酶解溫度(B)>酶解pH(C)>酶解時(shí)間(D),最優(yōu)組合為A2B2C2D3,即復(fù)合酶用量15 mg/g干姜粉,酶解溫度為55 ℃,酶解pH為5.5,酶解時(shí)間為1.25 h。由表5的方差分析結(jié)果可知,4個(gè)因素對(duì)姜辣素的提取均極顯著,其顯著性為復(fù)合酶用量(A)>酶解溫度(B)>酶解pH(C)>酶解時(shí)間(D),這說(shuō)明4個(gè)因素均是影響酶處理效果的關(guān)鍵因素,對(duì)姜辣素提取率有著重要的影響。

2.6.2 最優(yōu)工藝條件實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

按照正交實(shí)驗(yàn)得出的最優(yōu)工藝組合A2B2C2D3,即復(fù)合酶用量為15 mg/g干姜粉,酶解溫度為55 ℃,酶解pH為5.5,酶解時(shí)間為1.25 h,按照此條件處理干姜粉,以未經(jīng)酶處理的樣品為對(duì)照,提取姜辣素。在優(yōu)化條件下,姜辣素提取率達(dá)到(4.75±0.07)%,較乙醇直接提取的姜辣素提取率(2.57±0.06)提高84.82%,說(shuō)明在優(yōu)化后的酶解工藝條件下,復(fù)合酶可以更好地破壞生姜細(xì)胞結(jié)構(gòu),減輕姜辣素傳質(zhì)阻礙,促進(jìn)姜辣素溶出,從而提高姜辣素提取率。

2.7 姜辣素提取物對(duì)山茶油的抗氧化作用

2.7.1 姜辣素濃度對(duì)山茶油的抗氧化作用

取50 g/份的山茶油6份,分別添加不同體積的姜辣素提取物,使樣品中的姜辣素含量分別為50、100、150、200、250、300 μg/50 g山茶油,以不添加任何抗氧化劑的山茶油為陰性對(duì)照,以300 μg/50 g山茶油的BHT為陽(yáng)性對(duì)照,測(cè)定3～15 d時(shí)各樣品的過(guò)氧化值,結(jié)果見(jiàn)圖4。

注:GE,姜辣素提取物;50 μg GE每份樣品(50 g山茶油)中添加含姜辣素150 μg的姜辣素提取物進(jìn)行處理,以此類(lèi)推。

山茶油過(guò)氧化值隨時(shí)間的延長(zhǎng)均有不同程度的上升,但姜辣素提取物實(shí)驗(yàn)組過(guò)氧化值顯著低于空白對(duì)照,說(shuō)明姜辣素提取物有對(duì)山茶油具有較好的抗氧化作用。已有研究顯示,姜辣素具有良好的抗氧化特性,其抗氧化特性與姜辣素苯環(huán)上的羥基以及可以提高溶解度的側(cè)鏈相關(guān)[3, 32, 33]。姜辣素提取物對(duì)山茶油的抗氧化作用隨提取物姜辣素濃度的提高而增強(qiáng),處理15 d,50、100、150、200、250、300μg/50 g山茶油實(shí)驗(yàn)組過(guò)氧化值較空白對(duì)照分別降低15.53%、26.24%、31.05%、39.28%、43.40%、46.21%。Si等[3]研究姜辣素提取物對(duì)菜籽油抗氧化作用的結(jié)果亦證實(shí),姜辣素提取物的抗氧化作用與姜辣素濃度正相關(guān),這與本研究的結(jié)果一致。但是,姜辣素提取物實(shí)驗(yàn)組的過(guò)氧化值仍顯著高于BHT實(shí)驗(yàn)組,處理15 d,BHT實(shí)驗(yàn)組過(guò)氧化值僅為300 μg/50 g山茶油實(shí)驗(yàn)組的34.93%,說(shuō)明姜辣素提取物抗氧化性能與BHT相比仍有一定差距。

2.7.2 姜辣素組分與姜辣素提取物復(fù)配對(duì)山茶油的抗氧化作用

圖5結(jié)果顯示,雖然姜辣素提取物對(duì)山茶油的抗氧化作用隨姜辣素濃度的提高而增強(qiáng),但與合成抗氧化劑BHT仍有較大差距。如若繼續(xù)提高姜辣素濃度,雖可提高抗氧化效果,但亦會(huì)影響山茶油的風(fēng)味、口感和色澤。為此,在保持姜辣素含量為300 μg/50 g山茶油的前提下,將姜辣素提取物分別與6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚按質(zhì)量比1∶1進(jìn)行復(fù)配,以不添加任何抗氧化劑的山茶油為空白對(duì)照,以300 μg/50 g山茶油的BHT為陽(yáng)性對(duì)照,考察其對(duì)山茶油抗氧化作用的影響。

注:GE,姜辣素提取物;150 μg GE+150 μg 6-姜酚表示每份樣品(50 g山茶油)中加有150 μg的6-姜酚標(biāo)準(zhǔn)品以及含姜辣素150 μg的姜辣素提取物,以此類(lèi)推。

6-姜酚與姜辣素提取物復(fù)配組過(guò)氧化值顯著高于單一姜辣素提取物處理組,說(shuō)明6-姜酚對(duì)姜辣素提取物的山茶油抗氧化具有拮抗作用。但是8-姜酚、10-姜酚和6-姜烯酚復(fù)配組過(guò)氧化值均顯著低于單一姜辣素提取物處理組,與陽(yáng)性對(duì)照BHT較為接近,三者無(wú)明顯差異,這說(shuō)明8-姜酚、10-姜酚和6-姜烯酚均對(duì)姜辣素提取物的山茶油抗氧化具有協(xié)同增效作用,且其抗氧化效果與化學(xué)抗氧化劑BHT較為接近。生姜中含量最高的姜辣素為6-姜酚,質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過(guò)60%[22]。但是,Ko等[34]研究發(fā)現(xiàn),姜辣素提取物抗氧化性能與6-姜烯酚濃度正相關(guān);Dugasani等[35]通過(guò)自由基清除實(shí)驗(yàn)比較了4種姜辣素的抗氧化性能,結(jié)果顯示抗氧化性能6-姜烯酚>10-姜酚>8-姜酚>6-姜酚,并推測(cè)可能是6-姜烯酚的不飽和雙鍵和10-姜酚、8-姜酚側(cè)鏈長(zhǎng)度的增加導(dǎo)致了抗氧化性能的提高。

3 結(jié)論

淀粉酶和纖維素酶復(fù)合酶處理對(duì)生姜姜辣素的提取具有協(xié)同增效作用,通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了酶輔助處理提取姜辣素工藝條件,得到最佳工藝條件為,復(fù)合酶中淀粉酶纖維素酶配比3∶2,酶用量15 mg/g干姜粉,酶解溫度55 ℃,酶解pH為5.5,酶解時(shí)間1.25 h,在此條件下,姜辣素提取率達(dá)到(4.75±0.07)%,質(zhì)量濃度為0.293 g/mL。姜辣素提取物對(duì)山茶油的具有較好的抗氧化作用,并隨提取物姜辣素濃度的提高而增強(qiáng),但與化學(xué)抗氧化劑BHT仍有一定差距;8-姜酚、10-姜酚和6-姜烯酚與姜辣素提取物復(fù)配,均對(duì)山茶油抗氧化具有協(xié)同增效作用,其抗氧化效果與BHT較為接近。