高速逆流色譜法分離脂肪酸的應(yīng)用

鐘子豪, 蘭 鴿, 王鐲歷, 董 馳, 鄒慧文, 白 希

(新疆師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,烏魯木齊 830054)

脂肪酸是人體重要營養(yǎng)成分,在機(jī)體生長發(fā)育中發(fā)揮著特殊的生理學(xué)作用。ω-3和ω-6多不飽和脂肪酸(PUFAs)作為人體必需脂肪酸,顯示出良好的抗癌、抗衰老活性[1,2],在維持機(jī)體生理平衡上發(fā)揮重要作用;羥基不飽和脂肪酸(HUFAs)作為常見的含氧酸,大量存在于發(fā)酵食品中并影響其風(fēng)味[3],具有良好的降糖和抗炎活性[4],并展現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性[5],但目前HUFAs的抑菌機(jī)理暫不明確,亟需獲取高純度標(biāo)樣進(jìn)行探究。因此,高純度脂肪酸的分離已成為食品工業(yè)、制藥工程以及日用化工行業(yè)的研究熱點(diǎn)。

目前,分離脂肪酸傳統(tǒng)手段有減壓蒸餾法、溶劑萃取法、低溫結(jié)晶法、尿素包合法等,各類脂肪酸分離技術(shù)的原理、優(yōu)缺點(diǎn)及適用范圍對比如表1所示。采用傳統(tǒng)分離技術(shù)純化脂肪酸雖然簡便易行,但仍普遍存在分離純度低、溶劑消耗量大等缺陷。高速逆流色譜(HSCCC)是一種連續(xù)、高效的液-液分配分離技術(shù),基于各化合物在兩相溶劑中的分配系數(shù)(Partition coefficient, K)差異從而產(chǎn)生分離[12,13]。該方法相較傳統(tǒng)分離手段有著樣品回收率高、無不可逆吸附、分離程序靈活等特點(diǎn)[14],可滿足各類脂肪酸的分離需求。近年來,國內(nèi)外學(xué)者在HSCCC分離脂肪酸的應(yīng)用方面已取得較大研究進(jìn)展,如HSCCC分離功能性PUFAs的方法學(xué)考察以及分離產(chǎn)物在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域得到應(yīng)用[15];Simon等[16]側(cè)重對HSCCC儀器構(gòu)造的改進(jìn)與洗脫模式的創(chuàng)新;Liang等[17]則聚焦利用HSCCC分離食品和油脂中的HUFAs,以揭示其形成機(jī)理和抑菌活性。文章結(jié)合近年來國內(nèi)外研究者的相關(guān)工作,從溶劑體系、洗脫模式、檢測器及實(shí)際樣品應(yīng)用4個(gè)方面對HSCCC分離純化脂肪酸的研究進(jìn)行綜述,以期為優(yōu)化HSCCC分離脂肪酸工藝條件提供參考。表2整理了近年來HSCCC在分離脂肪酸中的應(yīng)用。

表1 脂肪酸分離技術(shù)比較

表2 高速逆流色譜在分離脂肪酸中的應(yīng)用

1 高速逆流色譜分離脂肪酸溶劑體系

HSCCC作為液-液分配色譜,溶劑體系的選擇尤為重要,合適的K值是高效分離的前提。為使樣品在溶劑體系中有較高溶解度并避免產(chǎn)生變性、分解等問題,通常需控制目標(biāo)產(chǎn)物K值在0.5～2.0區(qū)間,若K值過小會導(dǎo)致樣品迅速被洗脫,未達(dá)到分離目的;而K值過大會浪費(fèi)大量時(shí)間和溶劑,降低分離效率。

1.1 經(jīng)典溶劑體系

目前HSCCC經(jīng)典的3種溶劑體系有:由正己烷/乙酸乙酯/甲醇/正丁醇/水組成的Ito體系[40]、正庚烷/乙酸乙酯/甲醇/水組成的Arizona體系[41]以及正庚烷/正丁醇/乙腈/水組成的HBAW體系[42]。表2列舉了從各樣品中分離脂肪酸所使用的溶劑體系。為獲得理想的分離效果,所使用的溶劑體系需要與目標(biāo)脂肪酸極性匹配,滿足“相似相溶原理”。3種經(jīng)典溶劑體系均采用弱極性與強(qiáng)極性溶劑形成兩相溶劑體系,再選擇性添加中等極性溶劑加以改善的調(diào)配思路。其中弱極性溶劑常采用正己烷、正庚烷作為體系中的脂溶性溶劑,使脂肪酸溶解于其中;而強(qiáng)極性溶劑通常選用甲醇、乙醇、乙腈、水等,用于拓寬溶劑體系分離極性范圍;常用的中等極性調(diào)節(jié)劑有乙酸乙酯、正丁醇等,針對目標(biāo)脂肪酸的極性選擇性添加適量中等極性調(diào)節(jié)劑,可改善整體溶劑體系極性強(qiáng)度,使樣品在溶劑中獲得較高溶解度。

3種經(jīng)典溶劑體系所適用的分離類型有較大差異,這與各體系的溶劑組成有關(guān)。Ito體系主要采用強(qiáng)極性的甲醇、乙醇以及水作為調(diào)節(jié)劑,可有效拓寬分離極性范圍,對各類脂肪酸進(jìn)行有效分離;Arizona體系主要采用中等極性的乙酸乙酯作為調(diào)節(jié)劑,該體系分離極性范圍較窄,適用于極性較小的長鏈游離脂肪酸(如油酸、亞油酸等)以及羥基脂肪酸的分離;HBAW體系主要采用極性稍弱的乙腈代替水作為強(qiáng)極性溶劑,故其分離極性范圍也稍小,主要用于游離脂肪酸與脂肪酸乙酯的分離。

經(jīng)典溶劑體系雖為溶劑篩選指明了大致方向,但仍需結(jié)合目標(biāo)產(chǎn)物的性質(zhì)對溶劑體系進(jìn)行優(yōu)化,以達(dá)到最佳分離條件。其中Ito體系與Arizona體系所使用的基礎(chǔ)溶劑相似,2種基礎(chǔ)溶劑體系的差異主要在于篩選化合物K值的程序不同,且Arizona體系經(jīng)優(yōu)化后溶劑比例僅少數(shù)符合要求(Arizona體系需滿足V乙酸乙酯∶V水=1∶1或V正己烷∶V甲醇=1∶1),因此,這2種溶劑體系并無明顯的界限。

此外,部分學(xué)者在HBAW體系基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn),探索出更適合弱極性脂肪酸(二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸等)分離的無水溶劑體系。該體系僅采用弱極性的正己烷、正庚烷與強(qiáng)極性的乙腈配比組成兩相溶劑體系[43]。無水溶劑體系配比簡單、回收便捷,常用于脂肪酸乙酯的分離。

脂肪酸在溶液中存在的弱電離平衡,使得羧基有質(zhì)子化(COOH)和去質(zhì)子化(COO-)2種存在形態(tài),從而產(chǎn)生疏水性差異,而COO-在分離時(shí)會表現(xiàn)出拖尾寬峰,降低分離純度,所以可在溶劑體系中添加適量(體積分?jǐn)?shù)約為0.1%)乙酸、三氟乙酸或檸檬酸,降低溶劑體系pH值以抑制脂肪酸解離,這與Ito[40]提及的觀點(diǎn)相吻合。

1.2 含選擇性試劑的溶劑體系

鑒于HSCCC理論塔板數(shù)較低,僅采用基礎(chǔ)兩相溶劑體系對結(jié)構(gòu)相似的化合物分離效果不佳,可向基礎(chǔ)溶劑體系中添加選擇性試劑,以改善體系分配平衡及化合物K值[44],從而縮短分離時(shí)間、提升分離效率。目前HSCCC分離脂肪酸常用的選擇性試劑有金屬離子選擇性試劑和離子液體。

1.2.1 含金屬離子的溶劑體系

金屬離子選擇性試劑是含有Ag+、Cu2+等金屬離子的溶液,這類金屬離子含有空的d軌道,能夠接收PUFAs雙鍵的π電子,并與之可逆地形成弱配位化合物,從而降低目標(biāo)化合物K值,提升分離效率和選擇性[45]。香榧子是我國獨(dú)有的木本油料樹種,種子中PUFAs質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)79%,其中ω-6三元PUFAs—金松酸含量尤為豐富。據(jù)研究證實(shí),金松酸有抗氧化、驅(qū)風(fēng)鎮(zhèn)咳等生理活性[46],可作為藥食兩用原料進(jìn)一步開發(fā)。孟祥河等[47]將香榧子油乙酯化后,以無水體系(V正己烷∶V乙腈=1∶1)作為溶劑基礎(chǔ),分別考察添加硝酸銀、三氟乙酸銀、辛酸銀等銀鹽后的分離效果。結(jié)果表明,在固定相中添加1.2 g辛酸銀為最優(yōu)銀離子試劑,經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)離線檢測,分離得到的金松酸乙酯純度達(dá)86.78%,較未添加銀鹽的陰性對照組純度提升68.95%,表明添加合適的金屬離子試劑可有效提升分離純度。此外,金屬離子選擇性試劑還可有效解決共洗脫問題,尤其是針對相同等效鏈長值(ECL)脂肪酸之間的分離。Vetter等[48]以Ito體系(V正己烷∶V甲醇∶V水=3∶24∶1)作為基礎(chǔ)溶劑體系,按體積分?jǐn)?shù)1%的比例添加硝酸銀至水溶液中作為銀離子試劑,從芥末油脂肪酸甲酯中分離出純度為94%的芥酸甲酯,解決了與花生酸甲酯的共同洗脫問題(芥酸和花生酸ECL均為20)。值得注意的是,由于選擇性試劑中金屬離子的添加,難免會對純化產(chǎn)物造成污染及殘留,并限制其后續(xù)在保健食品中的應(yīng)用。

1.2.2 含離子液體的溶劑體系

離子液體(ILs)是一類全部由離子組成的有機(jī)鹽液體,因其具有蒸汽壓低、穩(wěn)定性高、易脫除回收等特點(diǎn),被視為傳統(tǒng)溶劑的“綠色替代品”,已在天然產(chǎn)物分離中得到廣泛應(yīng)用[49]。ILs通過豐富的陰陽離子組合調(diào)節(jié)上、下相極性,從而優(yōu)化目標(biāo)化合物K值,提升溶劑體系選擇性[50]。二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)是魚油中主要營養(yǎng)成分,在促進(jìn)大腦發(fā)育、增強(qiáng)人體免疫中起到重要作用[51,52]。Chen等[53]以無水體系(V正庚烷∶V甲醇=1∶1)作為兩相溶劑,對比ILs中不同陽離子鏈長及濃度的分離效果,最終選擇添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的1-丙基-3-甲基-胍氯鹽[C3Gun]Cl作為基礎(chǔ)溶劑體系的改性劑,將K值相近的二十碳五烯酸乙酯(EPAEE)與二十二碳六烯酸乙酯(DHAEE)峰重疊率從89%降低至47%,并成功從480 mg精制魚油樣品中提取分離出62.5 mg純度為96.92%的EPAEE和355.4 mg純度為95.12%的DHAEE;同時(shí)設(shè)計(jì)旋蒸濃縮及真空干燥回收方式,使ILs回收率達(dá)到87%。為闡明添加ILs后的分離機(jī)理,構(gòu)建了類導(dǎo)體屏蔽片段活度系數(shù)模型,通過計(jì)算發(fā)現(xiàn),添加ILs后改變了目標(biāo)產(chǎn)物氫鍵的結(jié)合方式,使溶劑體系與EPAEE、DHAEE的極性更匹配[54],從而大幅度降低峰重疊率,有效提升分離效率[55]。

2 高速逆流色譜分離脂肪酸的洗脫模式

基于HSCCC固定相的流體特性,已開發(fā)出多種適用于脂肪酸分離純化的洗脫模式。目前,HSCCC分離脂肪酸常見的洗脫模式有:pH區(qū)帶精制模式、洗脫推擠模式以及并流洗脫模式等[14],對于結(jié)構(gòu)相似或成分復(fù)雜的脂肪酸,可結(jié)合多種洗脫模式以提升純化效率。

2.1 pH區(qū)帶精制模式

pH區(qū)帶精制模式是一種基于待分離產(chǎn)物酸性解離常數(shù)(pKa)和疏水性差異建立起來的特殊分離制備模式,通過向基礎(chǔ)溶劑體系中加入保留酸和洗脫堿以形成穩(wěn)定的pH區(qū)帶,使不同化合物按pH值依次排列并被洗脫出來[56],其中常用的保留酸有三氟乙酸、乙酸、丙酸以及正丁酸等,洗脫堿有氫氧化鈉、氨水等。pH區(qū)帶精制模式作為分離復(fù)雜脂肪酸常用的洗脫模式,具有分離容量大、分離純度高等特點(diǎn),適用于分離在溶劑體系中穩(wěn)定解離的化合物,也可根據(jù)流出液pH值變化曲線對無生色團(tuán)化合物加以分離。在反相洗脫模式(常規(guī)模式)下,直鏈PUFAs的分離會由于ECL相近產(chǎn)生共同洗脫問題,導(dǎo)致分離效果不佳,而pH區(qū)帶精制模式基于不同結(jié)構(gòu)脂肪酸弱解離后pKa值的差異,可將ECL值相近的脂肪酸完全分開,破解這一難題。Englert等[32]以HBAW體系(V正己烷∶V乙腈∶V甲醇∶V水=4.0∶7.0∶1.4∶0.5)作為溶劑體系,比較在反相洗脫模式與pH區(qū)帶精制模式下對葵花籽油的分離效果。通過蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)及紫外-可見檢測器(UV-Vis)流出色譜曲線發(fā)現(xiàn),在反相洗脫模式下,ECL相同的油酸(OA)和棕櫚酸峰重疊率極高,僅能對一小部分未重疊的OA進(jìn)行有效分離,可分離量僅占總脂肪酸質(zhì)量的5%;而采用pH區(qū)帶精制模式,以三氟乙酸和氨水作為保留酸和洗脫堿,在相同條件下可從500 mg葵花籽油中分離獲得純度為98%的棕櫚酸88.0 mg和純度為95%的OA 104.3 mg,表明pH區(qū)帶精制模式可有效解決ECL共洗脫問題。此外,pH區(qū)帶精制模式在不降低分離度的條件下,可大幅度提升單次負(fù)載量。Han等[18-57]選用Ito體系(V正己烷∶V甲醇∶V水=10∶5∶5)作為基礎(chǔ)兩相溶劑,分別向固定相和流動相中加入30 mmol/L三氟乙酸和10 mmol/L氨水作為保留酸及洗脫堿以形成穩(wěn)定的pH區(qū)帶,在pH區(qū)帶精制模式下從18 000 mg 紫蘇籽油游離脂肪酸中分離制備得到9 676.7 mg純度為92.79%的α-亞麻酸(ALA),解決了OA、亞油酸(LA)與ALA的共洗脫問題。與此同時(shí),pH區(qū)帶精制模式與普通制備型逆流色譜相比,單次載樣量提高了20倍,有望成為ALA工業(yè)化制備的有效途徑。呋喃脂肪酸因具有清除自由基、緩解損傷等功效[58,59],被視為有價(jià)值、有生理活性的脂肪酸。Englert等[21]以HBAW體系(V正己烷∶V乙腈∶V甲醇∶V水=4.0∶7.0∶1.4∶0.5)為溶劑體系,分別向上、下相中添加35 mmol/L三氟乙酸和20 mmol/L氨水,采用pH區(qū)帶精制模式從210 mg橡膠乳脂肪酸中分離出純度為95%的9-(3-甲基-5-戊基呋喃-2-基)-壬酸[9M5] 48.4 mg,并在反相洗脫模式以Ito體系(V正庚烷∶V甲醇∶V水=4.00∶3.64∶0.36)作為兩相溶劑,對分離出的9M5流分進(jìn)一步純化,使其最終純度提升至99%,為緩解氧化脅迫誘導(dǎo)損傷相關(guān)研究提供藥物來源。這些研究實(shí)例表明,pH區(qū)帶精制模式可以有效解決相同ECL脂肪酸共洗脫問題,且其單次進(jìn)樣量大、回收率高,具有廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景。

2.2 洗脫推擠模式

洗脫推擠模式充分利用了HSCCC兩相均為液體的特性,待K值較小的化合物洗脫出來后,切換流路將固定相泵入并推擠出螺線管中K值較大的待分離組分,操作結(jié)束后螺線管內(nèi)固定相已被重新替換,可直接進(jìn)行下一次平衡與分離,從而實(shí)現(xiàn)連續(xù)性高通量分離[60]。該洗脫模式理論上可以按K值順序?qū)⑺薪M分依次洗脫出來,在一定程度上彌補(bǔ)所使用的溶劑體系分離極性范圍較窄的缺陷。Daniela等[39]以無水體系(V正庚烷∶V乙腈=5∶5)作為溶劑體系,在該模式下對裂壺藻油脂肪酸乙酯進(jìn)行10次連續(xù)進(jìn)樣,單次進(jìn)樣1 000 mg,在此溶劑體系中DHAEE和二十二碳五烯酸(DPAEE)的K值均偏大(K值分別為2.15和3.83),故先采用反相洗脫模式在22.5 min內(nèi)分離出DHAEE和DPAEE,再循環(huán)運(yùn)行9次洗脫推擠模式,最終在第10次洗脫下獲得純度為99%的DHAEE 1 797 mg和純度為97%的DPAEE2 164 mg,分離共耗時(shí)510 min,且在不降低分離度的情況下較僅使用反相洗脫模式節(jié)省約308 min。由此可見,洗脫推擠模式不僅拓寬了分離的K值范圍,節(jié)省了篩選優(yōu)化溶劑體系的時(shí)間,而且分離產(chǎn)物純度高,為連續(xù)性高通量的脂肪酸分離工藝提供路徑。

2.3 并流洗脫模式

并流洗脫是一種從根源縮短保留時(shí)間的洗脫模式,該模式擁有2套輸液泵可分別控制流動相與固定相的泵入,使其在螺線管中以不同流速同向流動。隨著固定相的不斷泵入,K值大的化合物在固定相中不斷向前移動,從根源上縮短了分離產(chǎn)物的保留時(shí)間,同時(shí)解決了K值大導(dǎo)致的譜帶展寬問題[61]。芝麻油中各化合物含量豐富,難以摸索出最佳的溶劑體系使K=0.03的弱極性植物甾醇到K=15的強(qiáng)極性芝麻素均獲得較高分離效率,而并流模式從根源上解決了這一難題。Simon等[16]采用HBAW體系(V正己烷∶V三氟化苯∶V乙腈=100∶35∶65) 作為溶劑體系,在并流模式下以固定相流速FS=4 mL/min、流動相流速FM=2 mL/min同時(shí)泵入螺線管,聯(lián)用ELSD監(jiān)測分離流分。由色譜流出曲線觀察到,弱極性的甾醇首先被洗脫出來(16～38 min),其次被洗脫出來的是中等極性的游離脂肪酸如棕櫚酸、硬脂酸等(45～53 min),最后被洗脫出來的是強(qiáng)極性的芝麻素(74～79 min)。經(jīng)GC-MS離線檢測,分離出的LA和芝麻素均不含雜質(zhì),表明并流模式可對組成復(fù)雜、K值差異化的樣品進(jìn)行有效分離,在縮短分離時(shí)間的同時(shí)也解決了譜帶展寬導(dǎo)致產(chǎn)物純度的問題。

3 高速逆流色譜分離脂肪酸常用檢測器

HSCCC作為一種高效的分離純化手段,配置的各類高靈敏度檢測器可滿足不同類型脂肪酸的檢測需求。從表2中可以看到,對于常見脂肪酸,如EPA、DHA等進(jìn)行分離制備時(shí),常選用HPLC、GC作為離線檢測器對分離產(chǎn)物進(jìn)行純度檢測;對于分離難度高、含量少的共軛體系PUFAs,如9M5進(jìn)行分離時(shí),可選用UV或DAD進(jìn)行檢測,以減少樣品檢測損耗;但對于多個(gè)未知脂肪酸的分離,則宜配置DAD作為檢測器,以便對分離流分進(jìn)行全譜掃描并篩選各化合物最佳波長,提升產(chǎn)物鑒別效率;在分離無紫外吸收或吸收較弱的脂肪酸時(shí),可選擇ELSD替代UV及DAD,其不依賴產(chǎn)物光學(xué)特性的優(yōu)點(diǎn),可快速、高效地辨識UV及DAD難以檢出的產(chǎn)物;對結(jié)構(gòu)新穎、復(fù)雜的脂肪酸,如HUFAs進(jìn)行分離時(shí),可選擇MS作為離線檢測器,獲取產(chǎn)物分子質(zhì)量及結(jié)構(gòu)等重要信息,也可選擇NMR作為離線檢測器,以確定脂肪酸具體結(jié)構(gòu),為脂肪酸的定性分析提供有力幫助。

4 高速逆流色譜在分離脂肪酸中的應(yīng)用

近年來,隨著人們對功能性糧油食品研究的不斷深入,人們逐漸意識到PUFAs在促進(jìn)大腦發(fā)育、預(yù)防心血管疾病等方面發(fā)揮著重大作用[62]。因ω-6 PUFAs會產(chǎn)生誘炎因子,而ω-3 PUFAs產(chǎn)生中性或抗炎因子,故其攝取比例的失衡會致使機(jī)體免疫系統(tǒng)誘發(fā)慢性炎癥[62],由此可見ω-3和ω-6 PUFAs在人體生長發(fā)育中起到不可或缺的作用;HUFAs是一類具有獨(dú)特抗菌活性的脂肪酸,其含量會影響食品風(fēng)味及營養(yǎng)組成[63],對食品健康有著重要意義。這些脂肪酸主要來源于動植物油脂、海洋藻類以及脂質(zhì)風(fēng)味食品,因此,近年來HSCCC分離脂肪酸的原料來源主要集中于油脂、藻類和脂質(zhì)風(fēng)味食品。

4.1 魚油

魚油是指從多脂魚類中提取出的全部油脂,其富含EPA、DHA等各類PUFAs,是人體攝取ω-3 PUFAs的主要來源之一,有促進(jìn)大腦發(fā)育、預(yù)防心血管疾病等生理活性[64]。鄭飛洋[37]以HBAW體系(V正庚烷∶V乙醇∶V乙腈=10∶5∶5)作為溶劑體系,在反相洗脫模式下從200 mg金槍魚油脂肪酸乙酯中分離純化出少量純度為85.76%的DHAEE。余琦等[34]依次采用HBAW體系(V正己烷∶V乙腈∶V甲醇=6∶4∶1)和Ito體系(V正己烷∶V甲醇∶V水=20∶20∶3)作為溶劑,在反相洗脫模式下分2步對魚油進(jìn)行分離純化。經(jīng)HPLC分析,最終獲得EPA純度為99.62%,DHA純度為99.60%。Lehnert等[24]以HBAW體系(V正己烷∶V甲醇∶V水=700∶350∶4)作為溶劑體系,在反相洗脫模式下將0.15 mg壬二酸甲酯對照品純度從80%提升至100%,并用作GC-MS標(biāo)樣對魚頭、魚肉組織中短鏈脂肪酸進(jìn)行定量分析。除此之外,魚油中還含有少量ω-6 PUFAs,其與ω-3 PUFAs的攝取比例在維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)上有重要作用[62-65]。Danli等[23]以HBAW體系(V正己烷∶V甲醇∶V水=350∶175∶2)作為溶劑體系對500 mg魚油脂肪酸甲酯進(jìn)行2次洗脫。GC-MS分析結(jié)果顯示:從魚油中共檢測出100余種脂肪酸,并成功分離出19.8 mg 純度為95%的ω-6 PUFAs-十六碳四烯酸甲酯。研究結(jié)果表明,反相洗脫模式雖具備從魚油中分離高純度活性脂肪酸(如EPA、DHA)的能力,但其單次分離量較少,難以滿足對脂肪酸的需求;而pH區(qū)帶精制模式在不降低分離效果的同時(shí),可實(shí)現(xiàn)g級制備及后續(xù)小型規(guī)?；蛛x純化的開發(fā)。Li等[22]以HBAW體系(V正庚烷∶V甲醇∶V水=100∶55∶45)作為兩相溶劑,分別向固定相和流動相中添加50 mmol/L三氟乙酸及40 mmol/L氫氧化鈉形成pH區(qū)帶,在pH區(qū)帶精制模式下分離500 mg精煉魚油,共得到純度為95.5%的EPA 79.6 mg和純度為96.9%的DHA 328.3 mg;同時(shí),增加保留酸濃度可提升固定相中產(chǎn)物濃度并延長保留時(shí)間,這是由于過量酸使羧酸的異質(zhì)二聚體完全解離,以形成更穩(wěn)定的pH區(qū)帶[66]。根據(jù)這一理論提升保留酸濃度至150 mmol/L,并對1 000 mg精制魚油進(jìn)行分離制備,經(jīng)GC-MS鑒定共得到純度為95.2%的EPA 132.4 mg和純度95.5%的DHA 617.1 mg。除此之外,還可添加ILs至溶劑體系中,以獲得更好的分離效果。Chen等[53]以無水體系(V正庚烷∶V甲醇=1∶1)作為兩相溶劑,添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%[C3Gun]Cl的ILs,從480 mg精制魚油乙酯樣品中提取分離出62.5 mg純度為96.92%的EPAEE和355.4 mg純度為95.12%的DHAEE,為功能性ω-3脂肪酸的高效分離提供參考。

4.2 藻油

藻類是富含ω-3 PUFAs的海洋自養(yǎng)生物,藻油相較魚油而言其脂肪酸種類簡單、便于提取且沒有腥味,無需精煉即可進(jìn)行下一步生產(chǎn)加工。裂壺藻作為藻類代表性品種,不僅來源廣泛,而且脂肪酸中ω-3 PUFAs含量更豐富[67],是目前藻油主要來源品種之一。吳兵兵等[31]利用響應(yīng)曲面法對HSCCC分離純化DHA的進(jìn)樣量、流速、轉(zhuǎn)速及溫度等關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,并采用兩步法分離純化裂壺藻中的游離脂肪酸。結(jié)果發(fā)現(xiàn):在溫度13 ℃、流速3 ml/L、轉(zhuǎn)速910 r/min的條件下,依次使用Arizona體系(V正庚烷∶V乙酸乙酯∶V甲醇∶V水=15∶1∶15∶1)和Ito體系(V正庚烷∶V甲醇∶V水=5∶6∶1)作為溶劑體系,可分別得到純度為90.06%和 99.61%的DHA。該工作提供了一種利用響應(yīng)曲面優(yōu)化HSCCC分離條件的策略,并表明HSCCC可采用多步分離的方法對DHA進(jìn)行高純度提取。Daniela等[39]以無水體系(V正庚烷∶V乙腈=5∶5)作為溶劑體系,在洗脫推擠模式下連續(xù)10次進(jìn)樣,從10 g裂壺藻乙酯油中分離出1 797 mg 純度99%的DHAEE和2 164 mg純度97%的DPAEE,并對該分離工藝進(jìn)行評估,有助于裂壺藻的高值化開發(fā)。此外,海藻被認(rèn)為是最有望成為DHA、EPA可持續(xù)高產(chǎn)的生物,為此人們對常見藻類進(jìn)行改性培養(yǎng),力求培育出脂肪酸含量更高的新品種,以滿足科研和市場需求。Simon等[25]為鑒別塔瑪亞歷山大藻菌株分支(Alex2, Ⅰ組),以Ito體系(V正己烷∶V甲醇∶V水=350∶175∶2)作為溶劑體系對混合藻油脂肪酸甲酯進(jìn)行分離,經(jīng)GC-MS檢驗(yàn),共分離純化出22種脂肪酸,其中OA、十八碳四烯酸、十八碳五烯酸等PUFAs占總脂肪酸質(zhì)量的80%,表明HSCCC對于成分復(fù)雜的樣品具有良好的分離效果,為后續(xù)建立脂肪酸定性專用質(zhì)譜庫、鑒別菌株分支奠定基礎(chǔ)。

4.3 植物油

植物油是指從果實(shí)、種子中得到的全部油脂,其PUFAs含量尤為豐富,是潛在的功能性油源?？ㄗ延妥鳛槲覈Ｓ玫募逭ㄓ皖?雖然較高比例的飽和脂肪酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為12%)可使其更耐煎炸[68],但長期食用這類脂肪酸會降低血液中高密度脂蛋白,不利于身體健康[69];而PUFAs(如OA、LA等)在具有良好抗氧化性的同時(shí)還有促進(jìn)機(jī)體代謝等生理功能。因此,可選用大宗食用油作為基礎(chǔ)油,添加適當(dāng)比例高純度PUFAs,調(diào)配獲得具有降脂等保健功能的調(diào)和油,以滿足大眾膳食脂肪酸營養(yǎng)需求。Englert等[32]利用pH區(qū)帶精制模式對500 mg葵花籽油進(jìn)行分離純化,以HBAW體系(V正己烷∶V乙腈∶V甲醇∶V水=4.0∶7.0∶1.4∶0.5)作為溶劑體系,選用三氟乙酸和氨水作為保留酸和洗脫堿,據(jù)ELSD和UV流出曲線顯示,分離獲得純度95%的OA 104.4 mg和純度95%的LA 194.2 mg。同理,Han等[18]在pH區(qū)帶精制模式下對600 mg紫蘇籽油進(jìn)行分離純化,選用Ito體系(V正己烷∶V甲醇∶V水=10∶5∶5)作為基礎(chǔ)兩相溶劑,三氟乙酸和氨水作為保留酸及洗脫堿,分離獲得純度分別為95.36%、89.55%、81.20%的ALA、LA和OA;Cao等[33]采用HBAW體系(V正庚烷∶V乙腈∶V乙酸∶V甲醇=4∶5∶1∶1)作為溶劑體系,對1 000 mg超臨界流體萃取的葡萄籽油進(jìn)行分離純化,獲得純度為99%的LA 430 mg。利用HSCCC的反相洗脫模式或pH區(qū)帶精制模式,可實(shí)現(xiàn)對植物油中功能性脂肪酸的分離純化,為后續(xù)進(jìn)一步開發(fā)營養(yǎng)均衡的功能性調(diào)和油提供原料。植物油中除含有PUFAs外,還含有活性功能獨(dú)特的HUFAs,其良好的抗真菌活性較傳統(tǒng)殺菌劑更安全、高效,這與其結(jié)構(gòu)有著緊密聯(lián)系[27-70]。為進(jìn)一步揭示HUFAs抗菌機(jī)理,亟需采用高效、溫和的手段進(jìn)行分離后進(jìn)一步探究。Liang等[17]從馬桑種子中回流萃取出馬桑籽油,經(jīng)堿水解皂化后得到202.6 mg游離脂肪酸,在Arizona體系(V正己烷∶V乙酸乙酯∶V甲醇∶V水=3.5∶1.5∶3.5∶2.0)作為溶劑體系的條件下,分離出13-羥基-9,11-十八碳二烯酸,并以LA、OA作為對照,對17種食物常見腐敗真菌進(jìn)行活性抑制測試,結(jié)果表明13-羥基-9,11-十八碳二烯酸的抗菌活性具有明顯的特異性:其對真菌孢子及菌絲有較強(qiáng)抑制活性,最低抑制濃度MICs<(0.67±0.29)g/L,且遠(yuǎn)高于LA、OA,MICs<(3.33±0.15)g/L;但對多數(shù)酵母菌無明顯抑制效果(MICs>8.00 g/L),有望成為天然抗真菌添加劑加以開發(fā)利用。

魚油中脂肪酸極性范圍較窄,常選用HBAW體系對魚油中的脂肪酸進(jìn)行分離純化;而藻油和植物油中脂肪酸極性范圍較廣,需采用Ito體系或Arizona體系。魚油和藻油中脂肪酸含量豐富且種類簡單,可選用反相洗脫模式;而植物油中脂肪酸種類復(fù)雜,需采用pH區(qū)帶精制模式或聯(lián)用其他分離純化手段才可進(jìn)行高純度脂肪酸的分離。此外,對于分離需求量較少的脂肪酸,可選用反相洗脫模式,而在規(guī)?；苽鋾r(shí),應(yīng)選擇pH區(qū)帶精制模式或洗脫推擠模式進(jìn)行高通量制備;亦或在反相洗脫模式的溶劑體系中添加ILs,以緩解高通量分離時(shí)拖尾峰所導(dǎo)致的分離度降低。建議謹(jǐn)慎使用金屬離子選擇性試劑,并對分離全過程中的金屬離子濃度進(jìn)行監(jiān)控,避免產(chǎn)物因重金屬含量過高而無法加以利用。

4.4 脂質(zhì)風(fēng)味食品

脂質(zhì)風(fēng)味食品是指將富含動植物油脂的物質(zhì)經(jīng)過油炸、發(fā)酵等工藝處理后得到的食物,其脂肪酸組成較魚油、藻油而言更豐富。其中HUFAs對食品風(fēng)味、保質(zhì)期以及營養(yǎng)有較大影響[71],例如香腸中微生物的發(fā)酵會影響其脂肪酸組成[72],進(jìn)而造成特征風(fēng)味及營養(yǎng)成分的改變。因此,對發(fā)酵過程中產(chǎn)生的脂肪酸進(jìn)行分離,有利于闡明發(fā)酵機(jī)理、優(yōu)化發(fā)酵工藝、改善特征風(fēng)味。Liang等[73]為探究香腸中脂肪酸代謝與發(fā)酵菌種、時(shí)間的關(guān)系,分別在滅菌香腸上接種了沙克乳酸桿菌(Lactobacillussakei)、肉葡萄球菌+沙克乳酸桿菌(Staphylococcuscarnosus+Lactobacillussakei),并與陰性組進(jìn)行對照。以Arizona體系(V正己烷∶V乙酸乙酯∶V甲醇∶V0.1%乙酸=4∶1∶4∶1)作為溶劑體系對發(fā)酵0、3、20 d的香腸脂肪酸進(jìn)行分離鑒定。經(jīng)GC-MS檢驗(yàn)表明,香腸中游離脂肪酸的總代謝速率并未因Lactobacillussakei與Staphylococcuscarnosus菌株的添加而改變,表明游離脂肪酸是由內(nèi)源性脂肪酶所產(chǎn)生;但菌株的添加會導(dǎo)致LA、ALA逐漸轉(zhuǎn)化為HUFAs,并對其風(fēng)味產(chǎn)生影響,這有助于通過定量分析脂肪酸組成判斷發(fā)酵階段及發(fā)酵質(zhì)量,進(jìn)一步改善發(fā)酵工藝。

5 總結(jié)與展望

對HSCCC分離脂肪酸的溶劑體系、分離模式、檢測器及實(shí)際應(yīng)用進(jìn)行了綜述。根據(jù)目標(biāo)脂肪酸的性質(zhì)可大致篩選溶劑體系(極性或非極性),對于難分離的化合物(結(jié)構(gòu)相似,ECL相同)可通過添加選擇性試劑(金屬離子或ILs等)以改善其分離效果;在模式選擇方面,HSCCC提供了多種洗脫模式(pH區(qū)帶精制模式、洗脫推擠模式、并流模式等)可實(shí)現(xiàn)脂肪酸的高效快速分離;同時(shí)HSCCC配備的多種檢測器(包括UV-Vis、ELSD、MS、NMR等)可對分離產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定,提高分離的準(zhǔn)確性。

HSCCC作為分離純化脂肪酸的重要手段之一,目前仍存在一些不足。HSCCC的理論塔板數(shù)較低,需要選用合適的溶劑體系或洗脫模式進(jìn)行彌補(bǔ);HSCCC僅能進(jìn)行定向分離,而對結(jié)構(gòu)新穎、活性強(qiáng)的脂肪酸暫無前端活性篩選方法進(jìn)行支持,需考慮與虛擬篩選結(jié)合提高分離的針對性;MS和NMR作為解析脂肪酸具體結(jié)構(gòu)的有力工具,暫未實(shí)現(xiàn)與HSCCC的在線聯(lián)用,常需要與其他專屬型檢測器(如ELSD)等聯(lián)用;HSCCC仍未實(shí)現(xiàn)活性脂肪酸的在線篩選,使其分離往往具有一定的盲目性,需在檢測器端增加對應(yīng)活性快速篩選系統(tǒng)。由此可見,HSCCC在脂肪酸分離純化領(lǐng)域尚有許多探索的空間。