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    基于近紅外光譜技術(shù)建立棉籽蛋白質(zhì)含量快速無損測定方法

    2024-05-08 08:25:14黃義文周大云黃龍雨吳玉珍付守陽
    中國糧油學(xué)報 2024年3期
    關(guān)鍵詞:棉籽定標(biāo)光譜

    楊 碩, 黃義文, 周大云, 黃龍雨, 吳玉珍,付守陽, 徐 青, 彭 軍,3, 匡 猛,3

    (中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所;棉花生物育種與綜合利用全國重點實驗室1,安陽 455000)

    (鄭州大學(xué)農(nóng)學(xué)院2,鄭州 450000)

    (三亞中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院國家南繁研究院3,三亞 572024)

    我國是世界第一產(chǎn)棉大國,長期以來棉花的利用價值主要集中于棉纖維,而棉纖維外的其他部分則利用尚不充分。棉籽是棉花生產(chǎn)過程中重要的副產(chǎn)物,主產(chǎn)品棉纖維分離后,每年能得到約750萬t的棉籽[1]。棉籽處理后蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%~70%,且氨基酸組成良好,營養(yǎng)價值豐富,還具有防脹氣、抗氧化和提高免疫力等功能[2]??梢宰鳛闃O佳的飼用蛋白或食用蛋白資源,是潛在的植物蛋白來源[5]。目前我國蛋白質(zhì)資源十分短缺,豆粕作為主要的飼料蛋白源,長期依賴國外進口,嚴(yán)重影響我國的糧食安全。棉籽中含有豐富的棉籽蛋白,是重要的非糧蛋白來源,提高非糧蛋白的利用率是保障我國糧食安全的重要途經(jīng)[9]。因此開發(fā)利用好棉籽蛋白資源,可以有效緩解我國蛋白源短缺問題,保障國家糧食安全。

    棉籽蛋白質(zhì)的含量是評價棉籽營養(yǎng)品質(zhì)的重要指標(biāo),明確不同材料間蛋白質(zhì)含量對棉花的綜合利用以及高蛋白品種選育具有重要意義,快速無損棉籽蛋白質(zhì)含量檢測方法在其中發(fā)揮到重要作用。目前棉籽蛋白質(zhì)含量測定主要依賴于各種化學(xué)方法,例如凱氏定氮法[10]、雙縮脲法[11]、Folin-酚試劑法[12]、紫外吸收法等[13],雖然化學(xué)方法具有檢測靈敏度高等優(yōu)點,但是依然存在著如檢測時操作步驟復(fù)雜,效率低下;需依賴各種精密儀器,使用大量化學(xué)試劑,造成環(huán)境污染;檢測時不可逆,破壞種子狀態(tài)等缺點[14],已無法滿足現(xiàn)代棉花綜合利用產(chǎn)業(yè)及棉籽優(yōu)質(zhì)蛋白育種中快速無損檢測的需求。

    近紅外光譜(NIRS)檢測技術(shù)是一種集現(xiàn)代電子技術(shù)、光譜分析技術(shù)、計算機技術(shù)及化學(xué)計量技術(shù)于一體的現(xiàn)代光譜分析檢測技術(shù)[15]。根據(jù)有機化合物中的含氫基團(C-H、N-H、O-H、S-H和P-H等)在近紅外光區(qū)域內(nèi)的振動吸收特性,可定性或定量地測定樣品的化學(xué)成分,具有無損、快速、環(huán)保和低成本等特點[17,18]。近紅外光譜檢測技術(shù)在花生[19]、玉米[20]、大豆[21]、油菜[22]等經(jīng)濟作物蛋白質(zhì)含量檢測中已得到廣泛應(yīng)用。使用傳統(tǒng)化學(xué)法對棉籽營養(yǎng)品質(zhì)進行檢測成本高、效率低且具有破壞性,用于檢測的種子不能再用于繁殖,不利于育種研究需求。所以建立一種快速、精準(zhǔn)且無損的棉籽蛋白質(zhì)含量檢測方法是開展棉籽營養(yǎng)品質(zhì)改良及棉籽綜合利用的關(guān)鍵。

    雖然目前關(guān)于棉籽蛋白質(zhì)含量的近紅外檢測技術(shù)已有報道[23,24],但是這些研究對象主要集中在光籽或種仁上,難以對毛籽樣品進行快速檢測,隨著棉花綜合利用產(chǎn)業(yè)的發(fā)展以及對棉籽優(yōu)質(zhì)營養(yǎng)品質(zhì)育種的重視,亟需一種快速無損棉籽蛋白質(zhì)含量檢測的方法。研究利用凱氏定氮法對187份棉籽樣品的蛋白質(zhì)含量進行檢測,分別采集了供試樣品的毛籽、光籽和種仁3種不同棉籽形態(tài)的近紅外光譜信息,結(jié)合改進的偏最小二乘法 (MPLS),通過不同散射處理和數(shù)學(xué)算法組合對光譜信息及化學(xué)值進行擬合,從而建立一種適應(yīng)不同棉籽形態(tài)的快速、無損、高效的棉籽蛋白質(zhì)檢測技術(shù),為棉籽綜合利用以及高品質(zhì)育種提供技術(shù)支撐。

    1 材料與方法

    1.1 實驗材料

    研究所用材料為187份棉花品種,由來自黃河流域棉區(qū)、長江流域棉區(qū)、西北內(nèi)陸棉區(qū)的棉種及國外品種構(gòu)成,于2020年棉花生長季種植在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所東場實驗站(36°10′N, 114°38′E)。每個材料5 m行長種植,行距0.8 m,所有田間管理按當(dāng)?shù)卮筇锷a(chǎn)管理進行。其中158份樣品作為定標(biāo)集用于近紅外模型建立,29份樣品作為驗證集用于定標(biāo)模型的外部驗證。

    1.2 樣品處理

    待測棉籽樣品在成熟后收取20鈴發(fā)育正常棉鈴。晾曬軋花后獲得帶有短毛絨的毛籽樣品,毛籽樣品經(jīng)濃硫酸脫絨處理得到棉花光籽樣品,對光籽樣品進行手工剝殼后獲得棉仁樣品,樣品使用前皆放置在45 ℃烘箱中烘干至恒重待用。

    1.3 成分測定

    剝殼粉碎后得到的棉仁粉采用凱氏定氮法測定棉籽仁蛋白質(zhì)含量,方法參照國家標(biāo)準(zhǔn)[25]。每個樣品采取3次重復(fù),相對誤差控制在2%以內(nèi),采用平均值作為此樣品蛋白質(zhì)含量的化學(xué)測定值。凱氏定氮使用儀器為8400KjeltecTM凱氏定氮儀。

    1.4 近紅外光譜掃描

    采用XDS型近紅外快速成分分析儀采集樣品的光譜信息。所有樣品掃描前均放置于溫度為25 ℃、相對濕度為60%的環(huán)境中進行水分平衡處理。掃描前將近紅外掃描儀開機預(yù)熱30 min,并需通過儀器自檢,消除外部噪聲干擾,減少實驗誤差。分別掃描毛籽、光籽和棉仁3種不同棉籽形態(tài)樣品,每份樣品重復(fù)掃描3次,掃描采用直徑為35 mm,高10 mm的圓形樣品杯。將棉籽樣品裝于圓形樣品杯中,用力壓實至于樣品杯高度齊平。光譜掃描波長范圍為400~2 500 nm,掃描頻率32 scan/s,每2 nm數(shù)據(jù)點間隔采集樣品的反射強度(R),取平均值并轉(zhuǎn)化為log(1/R),得到原始光譜數(shù)據(jù)儲存于計算機中。

    1.5 近紅外光譜模型建立

    利用WinISIⅢ軟件對采集的光譜數(shù)據(jù)進行分析,對原始樣品集合進行聚類分析計算,統(tǒng)計出與其他樣品的掃描光譜在光譜數(shù)據(jù)上有著顯著差別的樣品,剔除掉異常數(shù)據(jù)樣品。根據(jù)馬氏距離以任意一個樣品為中心,半徑為0.8以內(nèi)的樣品定義為相似樣品進行剔除,一定范圍只保留一個樣品,挑選得出的這些樣品能夠代表一定范圍光譜之間的差異,保證樣品的代表性。最終獲得一組既具有相似性,又能夠代表光譜間最大差異的定標(biāo)樣品集進行建模,以158份不同棉花品種作為建立模型的定標(biāo)樣品。采用無散射處理 (NONE)、標(biāo)準(zhǔn)正?;幚?(SNV)、去散射處理 (DET)、標(biāo)準(zhǔn)化聯(lián)合去散射處理(SNV+DET)、標(biāo)準(zhǔn)化多元散射校正 (SMSC)、加權(quán)多元離散校正(WMSC)、反向多元離散校正(IMSC)7種光譜散射處理方法及16種數(shù)學(xué)處理方法對定標(biāo)集樣品進行數(shù)據(jù)處理。光譜數(shù)據(jù)經(jīng)過不同處理后得到定標(biāo)模型,通過WinISIⅢ軟件給出的定標(biāo)相關(guān)系數(shù)(RSQ)、交叉驗證相關(guān)系數(shù) (1-VR)、標(biāo)準(zhǔn)誤差 (SEC) 及交叉檢驗標(biāo)準(zhǔn)誤差(SECV) 來判別定標(biāo)模型對其他未知樣品的預(yù)測能力。定標(biāo)模型建立后,用驗證樣品集的相關(guān)系數(shù)(R2)和預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEP)對定標(biāo)模型的預(yù)測性能進行評價。

    1.6 數(shù)據(jù)處理

    利用Microsoft Excel 2021數(shù)據(jù)分析工具對3種NIRS模型所用的定標(biāo)集和驗證集的棉籽蛋白質(zhì)含量進行數(shù)據(jù)分析,SPSS16.0軟件對驗證集的化學(xué)真值和預(yù)測值進行統(tǒng)計分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 棉籽蛋白質(zhì)含量化學(xué)值分析

    所有供試材料利用凱氏定氮法測定棉籽蛋白質(zhì)含量,其中定標(biāo)集158份樣品的棉籽蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)變異范圍為35.54%~53.34%,平均值為43.65%,標(biāo)準(zhǔn)差為4.59%。驗證集29份樣品的棉籽蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)變異范圍為34.55%~48.25%,平均值為41.97%,標(biāo)準(zhǔn)差為3.79%。建立模型的關(guān)鍵因素是建模所用的定標(biāo)集化學(xué)值是否覆蓋廣泛,一個覆蓋范圍廣的定標(biāo)集能夠提高檢測模型的精度和穩(wěn)定性[26]。本研究中定標(biāo)集樣品的棉籽蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為35.54%~53.34%,覆蓋廣泛,能夠較好滿足模型構(gòu)建的需求,基于此建立的近紅外光譜模型更具有普適性。此外,本研究篩選到了9份棉籽蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于50%的材料(表1),可為棉花高蛋白品質(zhì)育種和相關(guān)基因發(fā)掘提供種質(zhì)資源。本實驗的棉籽材料包含黃河流域、長江流域、西北內(nèi)陸等三大棉區(qū)的品種資源,品種來源較為豐富,但棉籽蛋白質(zhì)含量在平均值附近的材料較少,后續(xù)可以繼續(xù)補充模型樣品,提高適用性及穩(wěn)定性。

    表1 供試樣品中棉籽蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過50%的樣品信息

    2.2 近紅外光譜的采集

    利用XDS Rapid ContentTM分析儀采集毛籽、光籽和棉仁的近紅外光譜信息,獲得了3種不同棉籽形態(tài)的原始光譜 (圖1)。3種不同棉籽形態(tài)的原始光譜在不同波長下變化趨勢一致,同一棉籽形態(tài)不同樣品的光譜信息變化趨勢也是一致的,且不完全重合,表明近紅外光譜儀設(shè)備工作狀態(tài)良好,掃描的光譜信息質(zhì)量較高。進一步對3種棉籽模型的原始光譜進行一階導(dǎo)數(shù)處理來消除外部影響,處理后光譜 (圖2)減弱了基線偏移等影響,有效提高了光譜的精細(xì)度,更加明顯地展現(xiàn)了樣品所反映的光譜特征。

    圖1 3種棉籽形態(tài)的原始光譜圖

    圖2 3種棉籽形態(tài)預(yù)處理后的光譜圖

    2.3 不同數(shù)學(xué)處理對定標(biāo)方程的影響

    對光譜數(shù)據(jù)進行一些合適的處理可以消除外界因素的干擾,提高校正模型的預(yù)測性及穩(wěn)定性,常用求導(dǎo)數(shù)學(xué)處理消除基線漂移、降低顆粒度變化的影響及提高光譜的分辨率[27]。在全光譜范圍內(nèi),對原始光譜進行標(biāo)準(zhǔn)化聯(lián)合去散射處理(SNV+DET),并獲得不同數(shù)學(xué)處理下的定標(biāo)模型(表2)。未進行導(dǎo)數(shù)處理(0,0,1,1)時,毛籽、光籽和棉仁定標(biāo)模型的定標(biāo)相關(guān)系數(shù)RSQ及交叉驗證相關(guān)系數(shù)1-VR較小,且SEC和SECV誤差值均較大。對3種近紅外模型進一步利用16種數(shù)學(xué)處理,其中毛籽模型以(4,4,4,1)數(shù)學(xué)處理效果最好,最佳數(shù)學(xué)處理后的RSQ為0.955、SEC為0.957、SECV為1.388、1-VR為0.907;光籽模型以(4,6,6,1)數(shù)學(xué)處理模型效果最好,數(shù)學(xué)處理后RSQ為0.970、SEC為0.785、SECV為0.952、1-VR為0.957;棉仁模型以(1,4,4,1)數(shù)學(xué)處理模型效果最好,RSQ為0.989、SEC為0.475、SECV為0.589、1-VR為0.984。

    表2 不同數(shù)學(xué)處理對3種棉籽形態(tài)校正模型的影響

    2.4 不同散射處理對定標(biāo)方程的影響

    對近紅外光譜信息進行散射校正可以糾正化學(xué)值與近紅外吸光度之間的非線性扭曲,消除光譜中的樣品誤差,提高模型質(zhì)量[28]。在確定3種近紅外模型最佳數(shù)學(xué)處理的基礎(chǔ)上,對樣品光譜進行7種散射處理(表3)。毛籽模型中,進行IMSC處理時定標(biāo)模型效果較好,RSQ為0.957、SEC為0.946、SECV為1.370、1-VR為0.909;光籽模型中,進行WMSC處理時定標(biāo)模型效果較好,RSQ為0.971、SEC為0.777、SECV為0.940、1-VR為0.958;棉仁模型中,進行SNV+DET處理時定標(biāo)模型效果較好,RSQ為0.989、SEC為0.475、SECV為0.589、1-VR為0.984。

    表3 不同散射處理對3種棉籽形態(tài)校正模型的影響

    2.5 棉籽蛋白質(zhì)含量近紅外模型的驗證

    選取了建模樣品集以外的29個樣品對定標(biāo)的蛋白質(zhì)含量近紅外檢測模型進一步驗證。外部驗證結(jié)果如表4所示,毛籽、光籽及棉仁模型的外部驗證相關(guān)系數(shù)R2分別為0.947、0.962和0.980,SEP分別為0.885、0.787和0.530,3種模型的定標(biāo)相關(guān)系數(shù)均大于0.90,相關(guān)性較高,說明預(yù)測模型質(zhì)量較好。3種不同棉籽形態(tài)的近紅外檢測模型均可以快速準(zhǔn)確地測定棉籽中的蛋白質(zhì)含量,其中棉仁模型預(yù)測相對更精準(zhǔn)。

    表4 3種棉籽形態(tài)下蛋白質(zhì)含量測定模型的性能指標(biāo)

    將驗證集樣品通過凱氏定氮法測得的化學(xué)值與構(gòu)建的近紅外光譜模型所得的預(yù)測值進行比較,如圖3所示?;瘜W(xué)值與預(yù)測值的差值范圍較小,各模型的預(yù)測效果較好。化 學(xué)值及預(yù)測值差異顯著性t檢驗結(jié)果顯示差異不顯著,棉籽蛋白質(zhì)含量測定的毛籽、光籽及棉仁3種近紅外光譜模型驗證集的化學(xué)值及預(yù)測值間均沒有顯著性差異,模型預(yù)測的準(zhǔn)確度較高。

    圖3 驗證集棉籽蛋白質(zhì)含量的化學(xué)值及預(yù)測值

    本研究通過對3種不同形態(tài)的棉籽進行近紅外光譜的采集及數(shù)據(jù)處理,建立了毛籽、光籽及棉仁3種近紅外棉籽蛋白質(zhì)含量測定的定標(biāo)模型,毛籽、光籽和棉仁蛋白質(zhì)含量檢測模型的定標(biāo)決定系數(shù)分別為0.957、0.971和0.989,說明建立的棉籽蛋白質(zhì)含量檢測模型準(zhǔn)確度高、實用性強,預(yù)測結(jié)果的準(zhǔn)確性及可靠性與化學(xué)法相似,可以代替化學(xué)方法對棉籽中的蛋白質(zhì)含量進行測定。近紅外分析模型的結(jié)果準(zhǔn)確性與樣品、儀器及數(shù)據(jù)處理建模過程密切相關(guān),樣品狀態(tài)對于模型的影響主要體現(xiàn)在樣品的粒度、顏色、光滑度和所含雜質(zhì)等,樣品粒度的差異影響樣品對近紅外光的吸收和散射,進而導(dǎo)致光譜的變異[29]。樣品粒度大時,光學(xué)表面粗糙,對反射光譜及傳感系統(tǒng)造成影響,進而影響感受系統(tǒng)對樣品的反應(yīng),使得靈敏度及準(zhǔn)確度出現(xiàn)變化[30]。在本研究中構(gòu)建的3種棉籽蛋白質(zhì)含量近紅外檢測模型中,毛籽、光籽和棉仁定標(biāo)模型的相關(guān)系數(shù)RSQ依次遞增,由此可以表明蛋白質(zhì)大部分在集中在棉仁中,棉籽所帶的棉短絨及棉籽殼影響了樣品對近紅外光的散射和吸收。

    3 結(jié)論

    在目前我國蛋白質(zhì)資源短缺的情況下,棉籽蛋白質(zhì)作為非糧蛋白的重要來源,具有廣闊的市場前景和利用價值,快速無損環(huán)保的棉籽蛋白質(zhì)含量檢測方法在棉花綜合利用產(chǎn)業(yè)和棉籽營養(yǎng)品質(zhì)改良過程中將發(fā)揮重要作用。本研究通過采集毛籽、光籽和種仁3種不同棉籽形態(tài)的近紅外光譜信息和測定樣品中蛋白質(zhì)含量的化學(xué)值,通過不同數(shù)學(xué)處理、散射處理以及改良的偏最小二乘法構(gòu)建模型,并進行外部樣品驗證,3種模型的定標(biāo)相關(guān)系數(shù)均大于0.90,表明本研究建立的棉籽蛋白質(zhì)含量檢測模型能夠?qū)ξ粗獦悠愤M行精準(zhǔn)預(yù)測。

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