艱難梭菌毒素A適配子的篩選和鑒定*

劉紅菊，蘇 恒，吳愛武

(廣州醫(yī)科大學金域檢驗學院,廣州 510182)

艱難梭菌(Cd)在臨床上可引起抗生素相關性腹瀉等諸多感染性疾病，統(tǒng)稱為艱難梭菌感染(CDI)，其引起感染的主要毒力因子是產(chǎn)生毒素A(TcdA)和毒素B(TcdB)，TcdA為腸毒素，可引起腸壁分泌大量液體和出血性壞死，臨床通過檢測Cd是否產(chǎn)生上述毒素而輔助診斷CDI。TcdA的羧基末端(C端)為重復的寡肽結合區(qū)(CROP)，CROP既是TcdA與易感宿主細胞受體結合的區(qū)域，同時也是相應抗體阻斷TcdA結合宿主細胞表面的位點[1]。適配子是一種可以通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化(SELEX)技術篩選得到的具有識別功能的新型寡核苷酸鏈，其本質為單鏈DNA(ssDNA)或RNA片段，它們可以形成各種二級結構折疊成穩(wěn)定獨特的三維空間結構，與靶分子配體進行高親和力和特異性結合，與特異性抗體識別相應抗原表位過程類似，具有庫容量大、靶分子范圍廣、親和力高、特異性強等優(yōu)點，已成為實驗室診斷最熱門的研究領域之一[2-3]。本研究以重組TcdA蛋白為靶分子，采用SELEX技術，擬篩選與重組TcdA特異性結合的寡核苷酸適配子，以期為臨床實驗室快速診斷和治療CDI提供一定參考依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料 艱難梭菌產(chǎn)毒素A菌株為純化分離自臨床并保存于廣州醫(yī)科大學檢驗系實驗室的菌株[4],pET-28b為廣州醫(yī)科大學檢驗系實驗室保存質粒；E.coli-DH5α和E.coli-BL21感受態(tài)細胞購自北京天根生化科技有限公司。

1.2主要試劑 抗艱難梭菌毒素A抗體購自Abcom公司；UNIQ-10寡核苷酸純化試劑盒購自上海生工科技有限公司；T4 DNA連接酶、DNA Ladder、Premix Taq 聚合酶均購自Takara公司；羊抗鼠IgG-辣根過氧化物酶(HRP)購自Thermo Scientific公司；雙排磁力架、鏈霉親和素磁珠購自Invitrogen公司；tRNA購自Sigma公司；HRP標記-抗地高辛抗體購自美國Jackson公司；TMB檢測試劑盒購自北京鼎國生物有限公司。所有試劑均在有效期內使用。

1.3構建ssDNA文庫 構建長度為80 bp的隨機DNA文庫，引物和ssDNA文庫合成及測序由上海英濰捷基有限公司完成,文庫中所有ssDNA堿基序列從5′→3′的構成如下：5′-AGT CAG TAG TTC AGG CAG CG-40N-CAC AGC ACA CTC ACA CGC AC-3′，若中間為n個堿基的隨機序列，則ssDNA文庫量可達4n，本研究文庫中所有ssDNA序列中間為40個隨機堿基序列，意味著本研究的DNA隨機文庫容量可達440。用于鏈霉親和素磁珠篩選的生物素標記物放在下游引物和中間的40個隨機堿基序列之間，即5′-AGT CAG TAG TTC AGG CAG CG-40N-biotin-CAC AGC ACA CTC ACA CGC AC-3′。

1.4方法

1.4.1艱難梭菌毒素A羧基末端序列的克隆、表達與純化 對純化獲得的重組TcdA蛋白采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行分析，并進行蛋白免疫印跡法(Western blot)鑒定[5]。

1.4.2聚合酶鏈反應(PCR)擴增優(yōu)化反應條件摸索 以合成的ssDNA隨機文庫作為模板，采用上下游引物進行PCR擴增獲得雙鏈DNA(dsDNA)，以ddH2O作為模板設立陰性對照。根據(jù)引物的解鏈溫度設置不同退火溫度，分別進行經(jīng)5、8、12、16、20、24、28個循環(huán)數(shù)的PCR。經(jīng)4%瓊脂糖凝膠電泳分析，觀察試驗結果，確定對稱PCR的最優(yōu)退火溫度和循環(huán)次數(shù)。

1.4.3SELEX篩選 根據(jù)文獻[6]操作流程進行TcdA適配子的SELEX篩選，取預定量純化重組蛋白TcdA包被于96孔板，同時用ddH2O設空白對照，4 ℃包被過夜，洗滌3次，空白對照孔和蛋白包被孔分別用3%牛血清清蛋白(BSA)封閉2 h。用10 pmol/μL的ssDNA先與空白對照孔結合45 min，反篩去除與BSA結合的ssDNA，并測定此時ssDNA濃度，再與蛋白包被孔結合45 min，洗滌6次，加入洗脫緩沖液在80 ℃下加熱15 min，洗脫下與TcdA結合的ssDNA，回收ssDNA并測定其濃度,每輪篩選所用量見表1。采用下游引物5′端標記生物素引物，PCR擴增ssDNA成dsDNA后，用0.1 mol/L的NaOH解離dsDNA成ssDNA，再采用鏈霉親和素包被磁珠分選并獲得反義ssDNA作為下一輪篩選的模板文庫，如此重復直至ssDNA文庫與TcdA結合率不再增加為止。

1.4.4ssDNA文庫與TcdA結合率測定 篩選純化后所得ssDNA文庫的總量與反篩后ssDNA文庫總量比值，即每輪文庫與蛋白的結合率。

表1 不同篩選輪數(shù)重組蛋白TcdA及ssDNA用量

1.4.5文庫的克隆和測序 將第12輪獲得的ssDNA擴增為dsDNA后，與pMDTM 19-T載體進行連接，導入DH5α感受態(tài)細胞于LB/氨芐青霉素/X-Gal/異丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)平板培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取60個轉化陽性菌落進行測序。

1.4.6適配子同源性和二級結構分析 根據(jù)測序結果，分別選擇DNA MAN軟件和mfold軟件進行序列同源性和二級結構分析。

1.4.7適配子-A22(Apt-A22)親和常數(shù)(KA)測定

1.4.7.1重組TcdA包被濃度確定 96微孔板每孔加入200 μL濃度分別為2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 μg/mL TcdA重組蛋白，同時設立空白對照孔，4 ℃包被過夜，洗滌3次后，空白對照孔和蛋白包被孔均加入200 μL封閉液，37 ℃封閉2 h。去除封閉液，洗滌緩沖液洗滌4次。在各蛋白孔中分別加入200 μL的40 ng/μL的Apt-A22溶液，37 ℃孵育2 h，洗滌緩沖液洗滌4次，向各反應孔中加入200 μL HRP標記的地高辛抗體稀釋液(稀釋度為1∶10 000)，37 ℃孵育45 min，磷酸鹽緩沖液洗滌5次，加入100 μL 3,3′5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色劑后37 ℃孵育30 min，后加入100 μL終止液終止反應，測定其光密度(OD)450值。

2 結 果

2.1TcdA在大腸埃希菌中的表達與鑒定 pET-28b-TcdA重組表達質粒的最佳表達條件為菌液600 nm波長OD值選擇0.6，誘導溫度為25 ℃，IPTG誘導終濃度取1.0 mmol/L，誘導時間取10 h，在35×103處出現(xiàn)了目的蛋白(泳道4)。按照此條件誘導重組質粒，收集細菌裂解液上清液和沉淀進行SDS-PAGE，目的蛋白表達量高，見圖1。Western blot結果顯示，TcdA抗體可識別目的蛋白，不能識別pET-28b菌株蛋白，見圖2。

注：1表示蛋白Marker條帶；2表示pET-28b經(jīng)IPTG誘導的上清液；3表示pET-28b經(jīng)IPTG誘導的沉淀；4表示pET-28b-TcdA經(jīng)IPTG誘導的上清液；5表示pET-28b-TcdA經(jīng)IPTG誘導的沉淀

圖1 pET-28b-TcdA重組質粒在最佳誘導表達條件下

菌液裂解液SDS-PAGE電泳分析

注：1表示PET-28b菌株蛋白；2表示目的蛋白

圖2目的蛋白的Western blot鑒定

2.2PCR擴增優(yōu)化反應條件 采用ssDNA文庫作為模板時，在PCR擴增過程中對其循環(huán)數(shù)與引物特異性退火溫度進行摸索，結果顯示，在退火溫度為55 ℃、循環(huán)數(shù)為8時，目的條帶顯示為單一條帶，且無非特異性條帶出現(xiàn)，見圖3。

注：M表示10 bp DNA Ladder；1表示PCR循環(huán)數(shù)為5；2表示PCR循環(huán)數(shù)為8；3表示PCR循環(huán)數(shù)為12；4表示PCR循環(huán)數(shù)為16；5表示PCR循環(huán)數(shù)為20；6表示PCR循環(huán)數(shù)為24；7表示PCR循環(huán)數(shù)為28

圖3采用ssDNA文庫作為模板進行PCR時

不同循環(huán)數(shù)下擴增結果

2.3各輪ssDNA隨機文庫與TcdA結合率 經(jīng)過12輪篩選，至第10、11、12輪篩選后適配子結合率變化不明顯，說明結合率峰值趨于飽和，達到44.6%，見圖4。

圖4 各輪隨機文庫與TcdA結合率

2.4克隆測序結果 TcdA篩選后克隆測序的有效適配子為50條。

2.5適配子序列同源性和二級結構分析 測序的50條有效適配子進行多序列比對，總體同源性為45.27%。將具有90%以上同源性的序列歸為一組，可分為6組：第1組包括Apt-A1、Apt-A3、Apt-A13、Apt-A23、Apt-A25、Apt-A37、Apt-A40、Apt-A57，其中前5個適配子序列完全相同，而Apt-A37、Apt-A57序列中均只有1個堿基與上述序列不同；第2組包括Apt-A5、Apt-A55，二者序列完全相同；第3組包括Apt-A17、Apt-A36，二者序列完全相同；第4組包括Apt-A14、Apt-A27、Apt-A58、Apt-A60、Apt-A43，其中前4個適配子序列完全相同，Apt-A43與前4條序列只有1個堿基不同；第5組包括Apt-A44、Apt-A59，二者序列完全相同；第6組包括Apt-A22、Apt-A29，二者序列完全相同。見表2。其余序列同源性均較低。二級結構分析結構最穩(wěn)定的TcdA適配子是Apt-A22，其自由能為dG=-1.30 kcal/mol。

2.6適配子KA測定

2.6.1重組蛋白TcdA包被濃度確定 當倍比系列濃度(2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 μg/mL)重組蛋白TcdA包被時，其OD450值分別為1.145、0.623、0.417、0.234、0.175、0.096、0.065，在蛋白濃度為2、1、0.5 μg/mL時，OD450值均在0.15～2.50，說明在此范圍內OD值與包被板的重組蛋白濃度有一定線性關系。選定重組蛋白濃度分別為2、1、0.5 μg/mL時，測定其與二級結構最穩(wěn)定的適配子Apt-A22的反應曲線。

表2 重組蛋白TcdA經(jīng)12輪SELEX篩選后獲得的同源性適配子序列

2.6.2Apt-A22與重組蛋白TcdA的KA測定 蛋白濃度為2 μg/mL、OD450為50%時，Apt-A22濃度約為1.373 ng/μL；蛋白濃度為1 μg/mL，OD450為50%時，Apt-A22濃度約為2.194 ng/μL；蛋白濃度為0.5 μg/mL、OD450為50%時，Apt-A22濃度約為3.76 ng/μL。將上述值代入公式計算相應KA，KA1=3.06×107M-1；KA2=1.60×107M-1；KA3=2.08×107M-1。因此適配子Apt-A22與重組蛋白TcdA的KA=2.25×107M-1，見圖5。

圖5 Apt-A22與TcdA重組蛋白親和曲線

3 討 論

TcdA的羧基末端可結合易感靶細胞表面的受體，介導TcdA進入細胞內，從而破壞細胞結構[1]。實驗室通過檢測TcdA羧基末端的存在，可輔助臨床診斷和阻斷CDI。本課題組前期工作已通過系列試驗在成功構建pET-28b-TcdA羧基末端表達載體的基礎上，將其轉化入大腸桿菌表達菌BL21中，并對其進行誘導表達及獲得純化目的蛋白，為相應適配子的篩選提供研究基礎。

在適配子篩選過程中，隨機文庫的構建、每輪PCR擴增條件的優(yōu)化、靶蛋白與文庫結合濃度的調整、次級文庫的制備等都是影響篩選的重要因素，需要進行反復摸索與驗證。本研究體外合成的ssDNA文庫隨機序列由40個堿基組成，理論上有440個隨機堿基序列文庫容量,可滿足SELEX篩選量的需要。在整個SELEX技術篩選過程中要多次重復進行對稱PCR擴增，以ssDNA隨機文庫作為模板，通過對稱PCR，可獲得大量dsDNA，這些dsDNA通過鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)分離隨機文庫，可獲得大量ssDNA，作為下一輪的篩選文庫。PCR擴增條件對PCR結果影響較大，為了獲得大量且特異性強的dsDNA產(chǎn)物，必須對PCR擴增循環(huán)條件進行優(yōu)化。本研究通過優(yōu)化PCR循環(huán)條件，結果顯示，在退火溫度為55.0 ℃、8個循環(huán)的條件下，于80 bp Ladder處成功檢測到單一而清晰的條帶，說明文庫構建成功。

文庫濃度與靶蛋白濃度比例是SELEX篩選過程中重要的環(huán)節(jié)之一，在初始階段，由于文庫中高親和力適配子濃度低，因此，在初始的幾輪篩選中，需使用較高濃度靶蛋白進行篩選。隨著篩選輪數(shù)增加，結合力更高、特異性更強的適配子相對富集，而親和力低的適配子逐漸淘汰，靶蛋白及ssDNA隨機文庫的用量均減少，但文庫量與靶蛋白濃度相對比例升高，使結合力更強的ssDNA競爭結合到相應的靶蛋白的結合靶點，以獲得特異性更強的適配子。本研究從第2輪開始加入tRNA，與ssDNA非特異性競爭結合靶蛋白，也有利于從隨機文庫淘汰低親和力的適配子。當篩選到第10～12輪時，結合率不再增加，說明目標適配子已得到富集。ssDNA二級結構是靶分子與適配子特異性結合的結構基礎，適配子主要是靠氫鍵和電荷與電荷之間的相互作用識別蛋白質[8-9]。本試驗采用適配子文庫的此特性，篩選出50條重組蛋白毒素A的有效適配子，通過同源樹圖進行分組，將同源性達到90%的分為一組，共分為6組。每個適配子序列相差1個堿基，其二級結構相差較大，適配子的二級結構主要以莖環(huán)為主，莖環(huán)結構可由序列的各個區(qū)域組成。適配子二級結構中的莖環(huán)越小，莖越長，則其結合力越好[10]。因此，根據(jù)二級結構分析，選擇結合力較好的適配子Apt-A22進行后續(xù)試驗的親和力計算。

BEATTY等[7]建立的測定抗原-抗體KA測定方法已被廣泛應用，適合測定抗體和包被抗原之間的KA，且隨后他們從理論到實踐均進行了驗證，嚴格控制ELISA時，其質量作用定律仍然適用。本研究利用非競爭ELISA進行TcdA與適配子KA測定和計算，Apt-A22的KA均值為2.25×107M-1，對應的解離常數(shù)值為44.5 nM，KA均到達107級，解離常數(shù)達到了nM級別。與OCHSNER等[11]篩選出的TcdA適配子和目前唯一被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準用于臨床治療的適配子比較，KA和解離常數(shù)相當[12]，由此說明本試驗所篩選的適配子有一定應用前景。

綜上所述，本研究成功利用SELEX技術篩選獲得了特異結合TcdA的高親和力的ssDNA適配子，有利于進一步研究各適配子與TcdA的親和力和結合位點，為后續(xù)適配子的應用研究奠定了基礎。